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TP lactate déshydrogénase

Par   •  24 Janvier 2018  •  3 206 Mots (13 Pages)  •  279 Vues

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Afin de mesurer l’activité enzymatique de la lactate déshydrogénase dans nos différents tubes, nous avons mesuré l’absorbance du NADH en fonction temps, se formant suite à l’oxydation du lactate. En effet, ce cofacteur à la propriété d’absorbée à 340 nm ce qui n’est pas le cas du NAD+. Il a donc fallu que la lactate déshydrogénase catalyse la réaction en direction de la formation du pyruvate et du NADH. Pour que cela soit possible nous avons utilisé une solution de substrats contenant du L-lactate et du NAD+ ainsi qu’une solution tampon de glycine et soude (NaOH) permettant de maintenir un pH vers 9. Ce pH basique est primordial car il correspond au pH optimum pour lequel l’enzyme catalyse l’oxydation du lactate. Un pH neutre, proche de celui physiologique, entrainerait la réaction inverse, ce qui n’est pas souhaitée.

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Dosage des protéines

Afin de pouvoir calculer l’activité spécifique dans l’extrait de départ et le tube E1, nous dûmes mesurer la masse de protéine contenue dans ces deux tubes. Pour réaliser cela, nous avons effectué une gamme étalon avec une solution d’albumine. Afin de connaître l’absorbance de notre gamme étalon et de nos tubes d’intérêts, nous avons utilisé la méthode colorimétrique de Bradford. Cette méthode utilise un colorant appelé Bleu de Coomassie qui lors de sa fixation de manière non covalente avec toutes les protéines, se colore en bleu. Nous avons ensuite effectué une lecture de l’absorbance de nos tubes et de notre gamme étalon avec le spectrophotomètre réglé sur 595 nm et tracé une courbe d’étalonnage de la gamme. Suite à l’absorbance lue pour nos deux tubes d’intérêts, nous avons grâce à la courbe d’étalonnage pu connaître la masse de protéines contenue dans l’extrait de départ et dans le tube E1.

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L’Electrophorèse

L’électrophorèse une techniques permettant la séparation et la caractérisation des molécules telles que des protéines ou des acides nucléiques. Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. Plusieurs types de support (gel, papier,…) peuvent être utilisés pour permettre la migration des molécules à séparer.

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Electrophorèse en milieu dénaturant (SDS-PAGE)

Afin de comparer les quantités de protéines différentes avant et après purification, nous avons réalisé une électrophorèse en milieu dénaturant permettant de séparer les différentes protéines contenue dans la fraction de départ et dans la fraction purifiée. Les protéines se séparent en fonction de leur poids moléculaire puisque le SDS (Sodium Dodécyle Sufate) chargé négativement se fixe aux protéines (1 SDS / 2 acides aminées). Ainsi, les protéines disposent toutes de charges négatives dont le nombre augmente en fonction du nombre d’acides aminés composant une protéine. La révélation a été faite au bleu de Coomassie qui colore toutes les protéines spécifiquement.

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Electrophorèse non dénaturante

Présente de nombreuses cellules de l’organisme, la lactate déshydrogénase est une protéine tétramérique constituée de quatre sous unités. Chez les mammifères deux types de sous unités existent, le type H (= Heart) et le type M (= Muscle). Par conséquent, en fonction de l’assemblage des sous-unités, on distingue cinq formes d’isoenzymes ayant chacune une localisation tissulaire plus ou moins précise :

LDH-1 (H4) : le cœur LDH-2 (H3M1) : le système réticulo-endothélial

LDH-3 (H2M2) : les poumons LDH-4 (H1M3) : les reins

LDH-5 (M4) : le foie et les muscles

Afin de connaître les différentes isoenzymes contenue dans notre purification de lactate déshydrogénase, nous avons effectué une électrophorèse non dénaturante qui sépare les protéines en fonction de leur charge. Les protéines chargées négativement migrent vers l’anode (+) tandis que les protéines chargées positivement migrent vers la cathode (-). Cette électrophorèse a été réalisée à un pH basique de 9 afin de séparer les isoenzymes de la lactate déshydrogénase en fonction de leur pH isoélectrique. Deux témoins avec les isoenzymes H4 et M4 ont été effectuée afin de comparer les résultats obtenus pour notre extrait de lactate déshydrogénase purifiée.

La révélation de cette électrophorèse non dénaturante s’est faite par mise en évidence spécifique de l’activité de la lactate déshydrogénase, qui s’est traduite par la formation d’un précipité bleu dû au Nitrobleu de Tétrazolium contenu dans le milieu réactionnel. En effet, ce milieu contient également du NAD+ et du L-lactate qui ont été converti en NADH ; H+ et Pyruvate, sous l’action de l’enzyme. Le transfert des ions H+ du NADH formé a réduit le Nitrobleu de Tétrazolium qui passe d’une couleur jaune (forme oxydée) à une couleur bleue (forme réduite).

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Résultats et Interprétations

La mesure de l’activité enzymatique résidant dans une cuve de spectrophotomètre contenant une solution de substrats et quelques µL de l’une de nos six fractions récupérées à l’issue de la chromatographie, nous a permis d’obtenir une courbe (Absorbance en fonction du temps) pour la fraction concernée. La manipulation ayant été effectuée pour les six fractions, nous avons obtenu six courbes ci jointes.

La courbe de l’extrait présente une variation correspondant à l’activité enzymatique de la lactate déshydrogénase. Nous pouvons en déduire que l’extrait contient bien notre enzyme d’intérêt.

Les courbes de la fraction non retenue ainsi que celle de la fraction de rinçage, ne démontre pas d’activité enzymatique. La lactate déshydrogénase n’est donc pas présente dans ces deux fractions. Cela nous permet d’en conclure que notre enzyme d’intérêt s’est bien fixé au gel de Cibacron.

En ce qui concerne les courbes de nos fractions purifiées, on remarque que seules les courbes des fractions E1 et E2 présentent une variation liée à l’activité de lactate déshydrogénase. Notre enzyme d’intérêt se trouve donc dans ces deux tubes. L’absence de variation

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