Biologie moléculaire

...

Ces enzymes sont produites par les bactéries afin de découper l’ADN des bactériophages qui les attaquent. La méthylase produite par la bactérie permet que les enzymes de restriction ne fonctionnent que sur l’ADN étranger.

C. Phosphatase alcaline

La phosphatase alcaline est une hydrolase qui permet de cliver une liaison phosphodiester en libérant un groupement hydroxyle et un phosphate. Son activité est optimale à pH basique. Elle est utilisée dans notre cas pour éviter l’autoligation spontanée (ou aidée par la T4 DNA ligase) du vecteur seul.

[pic 3]

D. T4 DNA ligase

[pic 4]

L’ADN ligase permet de lier le vecteur et l’insert ensemble. La ligase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester entre une extrémité 5’ P et une autre extrémité 3’OH. Cela peut se faire entre les bouts francs ou les bouts cohésifs. La ligase a besoin d’ATP.

La T4 DNA ligase provient du phage T4.

Dans le cadre de notre TP, seul le vecteur a été traité par la phosphatase alcaline. Ainsi, la ligase utilisera les 5’P de l’insert pour créer la liaison phosphodiester avec le vecteur.

III. Compétence

DO de la préculture 1 = 2,9

DO souhaitée = 0.05

On utilisera donc un volume de 0.52 mL de préculture pour un volume final de 30mL

[pic 5]

A une DO de 0.3, on se situe dans la phase exponentielle de croissance des bactéries.

CaCl2

Le chlorure de calcium permet aux ions divalents Ca2+ de former des nanopores réversibles dans la membrane des bactéries (membrane constituée de phospholipides chargés négativement).

[pic 6]

IV. Transformation

Le choc thermique (bref passage à 42°C de nos bactéries initialement à 4°C) permet d’agrandir les nanopores formés par le CaCl2. Cela permet de stimuler l’entrée du plasmide dans la bactérie, et ainsi améliorer le rendement de la transformation.

Le rendement de la transformation reste cependant toujours très faible.

VI. Infection

Pendant la nuit de lundi à mardi, les bactéries transformées par les vecteurs ont été ensemencées en présence de X-Gal, IPTG et de cellules fraîches.

Mardi matin:

- les bactéries fraîches se sont multipliées et ont formé un tapis cellulaire

- l’ADN du vecteur a été répliqué, ce qui a permis la production de nouveaux phages. Ces nouveaux phages sont allés infecter des bactéries saines, ce qui a ralenti leur croissance. Cela explique l’observation des plages de retard de croissance. Ces plages sont de couleur blanche si les vecteurs transmis contiennent l’insert. Elles sont de couleur bleue si les vecteurs transmis se sont refermés sur eux mêmes.

Résultats:

Témoin:

- 21 plages blanches

- 0 plage bleue

Essai:

- >1000 plages blanches qui se superposent

- 0 plage bleue

→ Le témoin a été contaminé par des bactéries transformées par le vecteur contenant l’insert, c’est à dire par de l’essai.

→ Notre essai était surement trop concentré en bactéries

→ Aucun vecteur ne s’est refermé sur lui-même

L’idéal serait d’observer uniquement des colonies blanches sur l’essai, et aucune plage de retard de croissance sur le témoin.

Intérêt du témoin :

Le témoin permet de vérifier que le vecteur ne s’est pas refermé sur lui-même. Si le vecteur s’était refermé sur lui-même, on aurait des colonies bleues.

Dans notre cas, on observe des colonies blanches sur notre boite témoin, donc on ne sait pas si l’essai n’est pas lui aussi contaminé. On ne peut donc pas utiliser notre essai.

VII. Extraction

- Première centrifugation : permet d’éliminer les bactéries qui restent dans le culot, et de récupérer les phages dans le surnageant.

- On refait une deuxième centri pour être vraiment surs de ne plus avoir de bactéries dans le milieu, on garde à nouveau le surnageant qui contient les phages.

- Action du PEG 8000 : c’est un détergent qui permet de faire précipiter les phages, et d’isoler l’ADN phagique. + Action du NaCl : rend le milieu isotonique, permet de faire exploser les membranes phagiques.

- On centrifuge alors 2 fois, en gardant à chaque fois le culot.

- Action du tampon TES : contient de l’EDTA est un chélateur d’ions bivalents, il protège l’ADN d’une éventuelle dégradation par des nucléases.

- Action du mélange contenant du phénol ; permet une extraction sélective de l’ADN, car élimine les protéines et les lipides.

- Centrifugation donne une phase inférieure contenant le phénol avec les protéines et lipides, + une phase aqueuse supérieure contenant l’ADN.

- Action du mélange contenant du chloroforme : permet d’éliminer les éventuelles traces de phénol.

- Centrifugation, on récupère à nouveau la phase aqueuse supérieure contenant l’ADN phagique.

- Action d’éthanol absolu + acétate de sodium : permet la précipitation de l’ADN.

⇒ L’ADN monocaténaire contenant l’insert est extrait.