Techniques de Biologie Moléculaire appliquée à la Médecine
Par Plum05 • 26 Mars 2018 • 1 565 Mots (7 Pages) • 663 Vues
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La mutation la plus fréquente fait 70 % de la population mondiale : ΔF508.
Elle entraîne une délétion de 3 bases (phenylalanine) en position 508 de l’exon 10 du gène.
- Clinique
Pathologie des secrétions exocrines
Epithelium respiratoire :
- Obstruction des voies respiratoires par secrétions muqueuses.
- Surinfection (Pseudomonas aeruginosa).
- Insuffisance respiratoire.
Epithélium digestif :
- Insuffisance pancréatique.
- Iléus méconial à révélation anté- ou néonatale.
- Stratégie Diagnostique
On ne va pas étudier les 600 mutations, on va faire des choix :
[pic 5]
- Technique OLA
OLA = Oligonucleotide Ligation Assay
Détection de 33 mutations:
S549N, S549R , R553X, G551D, V520F , DI507 , DF508 , Q493X, 1717-1(G/A), G542X, R560T, R347P, R347H, 3849+4(A/G) , W1282X, R334W, 1078delT, 3849+10 kb, R1162X, N1303K, 3659delC, 3905insT, A455E, R117H, Y122X, 2184(AA/G), 2789+5(G/A), 1898+1(G/A), 621+1(G/T), 711+1(G/T), G85E)
Le taux de couverture de la population d’île de France est de 80%
Principe de la technique OLA :
Cette technique marche avec 3 types de sens :
- Sondes mutantes qui détectent des mutations.
- Sondes normales qui reconnaissent l’ADN normal.
- Sondes communes qui sont situées sur un endroit normal et qui porte un fluorochrome.
[pic 6]
Protocole Opératoire
- PCR multiplex
On fait l’amplification de 11 séquences exoniques et 6 séquences introniques du gène CFTR par 15 paires d’amorces.
- Hybridation
Cchaque région amplifiée est hybridée avec 3 sondes distinctes :
*Les sondes « communes » : s’hybrident à la fois sur le brin normal et le brin muté marquées par un fluorophore FAM, TET ou HEX.
*Les sondes « mutées » et « normales » qui entrent en compétition pour se fixer sur le brin complémentaire.
- Ligation sonde « commune »/ sondes « mutée » ou « normale »
On fait la ligation des sondes spécifiques d’allèle hybridées avec la sonde « commune » elle-même fixée sur sa séquence spécifique par addition de T4 DNA Ligase
On forme ainsi un produit OLA.
- Analyse des produits OLA
Séparation par électrophorèse capillaire en gel de polyacrylamide 6% sur séquenceur automatique en fonction de la taille
Interprétation
Identification du produit OLA formé par les logiciels d’analyse en fonction de la taille et de la « couleur » du fluorophore
Electrophoregramme:
Absence de mutation :
11 pics bleus , 10 pics verts et 10 pics noirs clairement identifiés
Présence d’une mutation à l’état hétérozygote:
pic supplémentaire dans une des trois couleurs identifié en rouge
Présence d’une mutation à l’état homozygote:
nombre de pics inchangé mais taille légèrement différente
Profile OLA de patient normal
On a 11 pics bleus , 10 pics verts et 10 pics noirs clairement identifiés.
[pic 7]
Profil OLA de patient hétérozygote F508del
On identifie un pic supplémentaire dans une des trois couleurs identifié en rouge.
[pic 8]
Profil OLA d’un patient hétérozygote composite F508del/S549R
[pic 9]
Il faut confirmer le diagnostic, on le fait par PCR.
Confirmation de la mutation delta F508 par PCR
Mutation delta F508= délétion de 3 bases. On fait la PCR de l’exon 10.
On fait des étapes de dénaturation-renaturation, et migration sur un gel de polyacrylamide non dénaturant.
Visualisation sur gel:
- Sujets homozygotes : appariement entre amplimères mutés ou normaux sous forme unique : Homoduplex.
- Sujets hétérozygotes : appariement avec mismatch entre un amplimère muté et un amplimère normal : Homoduplex et hétéroduplex.
- Dystrophie Myotonique de Steinert
- Physiopathologie
Fréquence: 1/8000
Transmission: autosomique dominant avec phénomène d’anticipation (Au fur et à mesure des génération, la mutation augmente).
Anomalie Moléculaire:
K 19 q 13.2-13.9
Répétition de –(CTG)n dans la séquence 3’ non traduite du gène DMP.
- 5 normale.
- 36 intermédiaire → Transmission à l’enfant qui sera atteint.
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