TP de SFP

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Il faut ensuite utiliser du β-mercaptoéthanol ou du dithiotreitol (DTT) à chaud afin de rompre les liaisons di-sulfure inter ou intra-caténaires et obtenir des protéines linéaires (structure primaire)

Après ces traitements, migration, coloration au bleu de Coomassie et lavage du gel, on peut comparer le poids moléculaires des protéines dans les différentes fractions avec des marqueurs de poids moléculaire (un mélange de protéines dont la masse molaire est connue).

Sur le gel, chaque fraction laisse apparaître une ou plusieurs tâches en fonction du nombre de protéines présentes et par comparaisons aux marqueurs, on peut connaître quelles sont les protéines correspondant aux tâches.

Protocole :

- Préparation des gels d’électrophorèse dénaturants

- Installer les plaques de verre sur le support.

- Préparer les deux gels (consignes pour deux binômes).

Gel inférieur 12%

Gel supérieur 4%

Acrylamide bis 40% (mL)

3

0,5

Tris 3M pH8.8 (mL)

1,4

Tris 1 M pH 6,8 (mL)

0.7

Sucrose 66% (mL)

1,2

0,6

H2O (mL)

4,3

3,4

SDS 10% (µL)

100

50

APS 10% (µL)

60

30

TEMED (µL)

10

5

- Remplir rapidement l’espace entre les plaques jusqu’à 2 cm du haut de la petite plaque. Avant que le gel ne polymérise, déposer à la surface du gel environ 0,2 mL d’eau. Après 20 minutes, on distingue une interface indiquant que le gel a bien polymérisé. Enlever l’eau.

- Après, réaliser le mélange pour le gel supérieur à 4% dans un Erlen.

- Remplir rapidement l’espace entre les plaques et installer le peigne.

- Après polymérisation du gel de concentration, installer la plaque sur son support et remplir la cuve avec le tampon de migration : METTRE LE TAMPON

- Préparation des échantillons

- Diluer dans le tampon de charge suivant "tampon Tris-HCl 200 mM pH 8,8 ; EDTA 5mM ; SDS 2% (W/V) ; Saccharose 1M ; Bleu de bromophenol 0,01% (W/V) ; DTT 10 mM" (qui sera désigné par l’abréviation TD) les différentes fractions collectées lors de la purification, dans des tuves eppendorf et selon les directives suivantes :

- 50µL de TD avec 50µL de l’extrait bactérien non induit (EB-),

- 50µL de TD avec 50µL de l’extrait bactérien induit IPTG (EB+ ou charge),

- 50µL de TD avec 50µL de la fraction non retenue (NR) sur Nickel,

- 50µL de TD avec 50µL de la fraction de lavage 1 (L1) et

- 50µL de TD avec 50µL de la fraction d’élution choisie (E).

- Faire bouillir les échantillons pendant 5 minutes.

- Protéines de références

Un mélange de protéines de référence prêt à l’emploi est utilisé pour le gel dénaturant coloré au bleu de Coomassie et pour le gel qui servira au transfert.

- Dépôt des échantillons sur gel dénaturant

- Introduire 5 µL de la solution de protéines de référence dans le premier puits (marqueurs colorés pour le gel du western et non colorés pour le bleu de Coomassie).

- Déposer ensuite 25 µL de chaque échantillon dénaturé dans un puits (toujours deux binômes par gel).

- Les dépôts seront réalisés sur les deux gels, un gel sera révélé par coloration au bleu de Coomassie et un gel sera utilisé pour le western blot.

- Electrophorèse

- Faire migrer pendant une heure environ à 90 mA dans le tampon de migration dénaturant suivant : Tris 25mM/Glycine 0,1M pH 8,5 ; SDS 0,1%. Il est possible de suivre la progression du bleu de bromophénol.

- Lorsque le bleu de bromophénol est à environ 0,5 cm du bas du gel, arrêter l’électrophorèse.

- Récupérer le tampon de migration dans le flacon d’origine.

- Démouler le gel.

- L’orienter par une encoche.

Coloration au bleu de Coomassie

Principe :

Le bleu de Coomassie est un colorant absorbant à 595nm (dans le bleu) lorsqu’il est lié aux protéines. Il est utilisé pour révéler les protéines séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Le gel démoulé est trempé dans une solution acide de ce colorant (qui absorbait alors à 465nm) puis lavé plusieurs fois afin d’enlever l’excès de colorant.

Protocole :

- Dans la boîte en plastique adaptée, mettre 50mL de solution de coloration (solution fournie prête à l’emploi).

- Introduire les gels.

- Attendre 15mn.

- Récupérer le bain de coloration dans le flacon initial.

- Sans enlever le gel, rincer avec un petit volume d’eau.

- Laisser le gel se décolorer pendant au moins une heure avant de pouvoir lire.

Western-Blot

Principe :

Le western-blot (ou transfert de protéines) est une technique