TP Oxygraphie

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Effets de différents effecteurs :

Un effecteur est un corps chimique qui se lie avec l’enzyme et modifie la vitesse de la réaction qu’elle catalyse ; il existe 2 types d’effecteurs : les activateurs et les inhibiteurs. Ici, nous allons chercher à identifier 4 effecteurs différents.

- Tracé 3 :

-Ajout des mitochondries : on observe une légère pente qui montre qu’il y a une consommation d’O2, cette consommation est due à la présence de substrat dans les mitochondries.

-Ajout du succinate : on observe une augmentation de la consommation d’O2, le succinate permet d’avoir du FADH2 substrat réduit de complexe II de la chaine respiratoire.

-Ajout de l’effecteur jaune : on n’observe pas de différence de pente malgré l’ajout d’effecteur jaune. Nous pouvons donc penser que l’effecteur jaune n’agit pas au niveau des complexes II, III et IV de la chaine respiratoire.

-Ajout d’ADP : on n’observe pas de différence de consommation d’O2. Nous pouvons donc penser que l’effecteur jaune bloque l’ATP synthase, en effet malgré l’ajout d’ADP nous n’avons pas une augmentation du flux des électrons. Il peut s’agir de l’oligomycine A qui est un inhibiteur de l’ATP synthase. Il agît en bloquant le canal à protons de la sous-unité F0, de ce fait, les protons ne peuvent plus retourner dans la matrice mitochondriale à travers la membrane interne de la mitochondrie, ainsi le flux des électrons dans la chaine respiratoire se trouve ralentie.

-Ajout de l’effecteur vert : on observe une consommation O2. Ainsi nous pouvons penser que l’effecteur vert permet le fonctionnement de la chaine respiratoire malgré la présence de l’effecteur jaune sur l’ATP synthase. Il peut s’agir d’un agent qui permet l’entrée des protons dans la matrice mitochondriale : un agent découplant de la chaine respiratoire. Cela peut-être le 2,4 dinitrophenol : il s’agit d’un phénol substitué qui se dissout dans la membrane interne de la mitochondrie, il permet ainsi l’entrée des protons vers la matrice mitochondriale. L’agent découplant diminue le gradient de protons transmembranaire et favorise l’hydrolyse de l’ATP ainsi il stoppe l’effet indirect de l’oligomycine A sur le reste de la chaîne respiratoire ; il active les oxydations cellulaires, l’utilisation du FADH2 et de l’oxygène.

- Tracé 4 :

-Ajout des mitochondries : on observe, là encore, une légère consommation d’O2.

-Ajout du glutamate-malate : on observe une augmentation de la consommation en O2 grâce au fonctionnement du complexe I, car le glutamate-malate donne du NADH, H+.

-Ajout de l’effecteur rouge : on observe une diminution de la consommation en O2, la pente devient nulle. Ainsi, nous pouvons penser que l’effecteur rouge agit comme inhibiteur d’un des complexes de la chaine respiratoire.

-Ajout d’ADP : on n’observe pas de consommation O2. Ainsi l’effecteur rouge empêche la phosphorylation du l’ADP par l’ATP synthase, car elle ne reçoit plus de protons. L’effecteur rouge est donc un inhibiteur d’un des complexes de la chaine respiratoire.

-Ajout de succinate : on observe une augmentation de la consommation en O2. Ainsi l’effecteur rouge ajouté ne bloque pas le complexe II ni les complexes III et IV, puisqu’il y a une consommation d’O2. Nous pouvons donc confirmer que l’effecteur rouge inhibe le complexe I, il peut s’agir de la roténone un inhibiteur du complexe I. Cet inhibiteur empêche le transfert des électrons du complexe I vers l’ubiquinone (Coenzyme Q), cette inhibition va entrainer un ralentissement significatif de l’ensemble de la chaine respiratoire ainsi que l’arrêt de la production d’ATP.

-Ajout de l’effecteur bleu : on observe un arrêt de la consommation d’O2, exprimé par une pente nulle. Ainsi il peut s’agir d’un inhibiteur des complexes II, III ou IV.

-Ajout d’Ascorbate-TMPD : on observe une augmentation de la consommation d’O2. Or, nous savons que le mélange Ascorbate-TMPD est un donneur artificiel d’électrons au niveau du complexe IV. Donc, l’effecteur bleu ne peut être un inhibiteur du complexe IV. De ce fait, il bloque soit le complexe II soit le complexe III.

-Effet du cyanure : le cyanure est un inhibiteur du complexe IV de la chaine respiratoire, s’il avait été ajouté nous aurions observé un arrêt de la consommation d’O2. En effet, le cyanure arrête l’utilisation d’O2 par le complexe IV mais aussi l’arrêt de l’utilisation du cytochrome C : donneur d’électrons. Cela va diminuer l’activité des autres complexes de la chaine et arrêter la production d’ATP par l’ATP synthase.

- Tracé 5 :

Le tracé 5 nous permet de déterminer si l’effecteur bleu agit sur le complexe II ou III. Pour cela nous allons utiliser le glutamate-malate qui permettra aux électrons de venir du complexe I et de suivre le chemin I -> III -> IV. Si la consommation d’O2 continue cela signifie que l’effecteur bleu agit sur le complexe II ; tandis que si la consommation d’O2 s’arrête cela signifie que l’effecteur bleu inhibe le complexe III.

-Ajout de l’effecteur bleu : on observe un arrêt de la consommation d’O2, ainsi l’effecteur bleu est un inhibiteur du complexe III. Il peut s’agir de l’antimycine. L’antimycine inhibe le complexe III en ralentissant l’utilisation du coenzyme Q par ce complexe, en effet le coenzyme Q n’étant pas réoxydé, les complexes I ou II ne pourront pas utiliser leur accepteur d’hydrogène et seront inactifs. Ainsi l’ensemble de la chaine respiratoire sera grandement ralentie jusqu’à l’arrêt de la consommation d’O2

Mesure expérimentale de l’ATP/O :

La quantité d’ATP formé sera calculée à partir du dosage du glucose-6-Phosphate à l’aide du NADPH, H+ qui absorbe à 340 nm. La quantité d’oxygène sera déterminée graphiquement. L’ATP/O, permet de connaitre la quantité d’ATP produit pour une molécule d’oxygène, plus il est élevé plus il y a production d’ATP.

- Tracé 2 bis : (utilisation courbe 100% oxygène 19.2 cm)

-Ajout de glucose et de l’hexokinase : l’héxokinase catalyse la réaction suivante en dehors de la mitochondrie : Glucose + ATP →Glucose-6-Phosphate + ADP

L’ADP produit par cette réaction, entre dans la mitochondrie via une ATP/ADP