TP LDH

...

E1 :41% E2 :27.4% E3 :1.25% et Fraction non retenue :0.5%

Le rendement total s’élève donc à 69.65% de l’activité enzymatique totale dans l’extrait brut. Ce rendement parait bon mais il faut maintenant calculer l’enrichissement, un indicateur de la qualité de la purification.

Dosage de protéines avec la technique de Bradford.

Ici nous allons encore réaliser un dosage spectrophotométrique.

Nous réalisons une gamme étalon avec des solutions qui contiennent des quantités croissantes de BSA (une protéine bovine qui se fixe sur le réactif de Bradford), de l’eau et 0.5 mL réactif de Bradford pour déterminer la masse de protéines dans l’extrait brut et dans E1. Chaque solution fait 1mL.

On mesure les absorbances à ε=595nm et on trace le graphique disponible en annexe.

Pour chaque extrait nous faisons 2 mesures avec des solutions contenant des quantités différentes d’extraits, puis nous calculons la moyenne.

Comme l’extrait brut a une absorbance trop forte il faut le diluer si on veut conserver la relation de Beer Lambert, nous utilisons donc une fraction diluée 10 fois.

Ensuite, nous reportons les absorbances lues pour nos extraits (brut et E1) et nous pouvons lire les concentrations massiques en protéines en µg/mL. Nous les convertissons en mg/mL avec un produit en croix,

Exemple : 0.005mL→ 3.6µg donc 1ml→ 3.6x(1/0.005)=720µg=0.72mg

Il faut bien multiplier la concentration massique de l’extrait brut par 10 car il a été dilué 10 fois.

Ainsi nous obtenons des concentrations de 6.4mg/ml pour l’extrait brut et 0.13mg/ml pour E1.

Grâce à ces données on calcule l’activité spécifique de nos extraits, elle correspond au rapport de l’activité totale de la LDH dans un extrait sur la quantité totale de protéines dans cet extrait. Plus cette valeur est élevée plus l’extrait en question est pur, c’est-à-dire qu’il contient une forte proportion de LDH. On mesure l’activité spécifique en µmoles/min/mg. On a :

Activité spécifique extrait brut = 14.4/6.4 = 2.25 µmoles/min/mg

Activité spécifique E1 = 5.894/0.13 = 45.3 µmoles/min/mg

On a une activité spécifique très supérieure dans l’extrait E1, cela signifie qu’E1 contient une plus grande part de LDH dans les protéines totales que l’extrait brut.

Pour quantifier cette pureté plus importante on calcule l’enrichissement de E1, il est égal au rapport entre les activités spécifiques ci-dessus.

Enrichissement E1 = Act. Spé E1 / Act. Spé Extrait brut = 45.3/2.25 = 20.13.

On peut donc dire que E1 est 20 fois plus pur que l’extrait de départ.

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ANNEXE 2

Électrophorèse en milieu dénaturant

[a]

Nous aurions du faire une électrophorèse en milieu dénaturant SDS-PAGE afin de séparer par taille, poids moléculaire les différentes protéines, et ainsi pouvoir évaluer la qualité de notre purification. On a choisi de faire cette électrophorèse en milieu dénaturant avec un détergent anionique donc chargé négativement. On dit que le milieu est dénaturant car la protéine perd son repliement c’est à dire sa structure tertiaire, secondaire (et quaternaire si la protéine est composée de plusieurs sous unités/chaînes polypeptidiques). Ainsi il ne reste que la structure primaire de la protéine, toutes les liaisons sont réduites sauf les ponts disulfures. C’est pour ça que l’électrophorèse se fait en présence de β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures.

La révélations se fait au bleu de Coomassie qui est aspécifique et qui colorent donc toutes les protéines.

Interprétation :

Nous observons que l’extrait de départ contient un très grand nombre de protéines allant d’environ 97kDa à 31kDa. Mais on peut remarquer que la plupart des protéines se trouvent aux alentours de 66kDa. Cela est dû au fait que la LDH est un tétramère de 4 sous unités de 35kDa.[b]

Nous pouvons en effet observé deux bandes dominantes sur le dépot E1. Il y a un grand nombre de protéines qui se situent un peu au dessus de 31kDa à environ 35kDa cela correspond au tétramère de la LDH. La bande présente a 66kDa ne peut pas correspondre à la LDH car les différentes sous unités ont bien été séparés par le SDS-PAGE et le β-mercaptoéthanol. Il s’agit donc d’autres protéines car le ligand que nous utilisons est peu spécifique. Or d’autres enzymes utilisent le NADH,H+, elles auront donc une affinité avec les NADH et par conséquent avec le bleu de Cibacron. Ces protéines ne sont donc pas dénaturées. Nous pouvons donc en conclure que la purification de notre extrait de départ n’est que partielle.

ANNEXE 3

Électrophorèse en milieu non dénaturant

Dans cette électrophorèse, les différentes protéines qui ont gardé leur repliement et gardent donc leur activité; Elles vont se séparer selon leur charge. Plus la protéine sera anionique c’est à dire chargé négativement, plus elle sera attiré par le pôle positif autrement dit l’anode. Au contraire si une protéine migre vers la cathode c’est qu’elle est chargé positivement.

Cette fois notre coloration est plus spécifique car nous utilisons un mélange de lactate, NAD+, PMS et pNBT

A

Coeur : bande tres attirée vers le pole +

Foie : 4 bandes: 1 vers le pole -; 3 de plus en plus vers le +

Muscle : Surtout vers pole -

Rein : 5 bandes

Type H4 qui prédomine dans le muscle cardiaque H4 le plus négatif[pic 1]

Type M4 qui prédomine dans le muscle squelettique M4 le plus positif[pic 2]