TP HPLC

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L’enzyme a cependant un inconvénient, celui d’hydrolyser, lorsqu’on la laisse agir plus de temps que nécessaire, d’autres sites potentiels d’hydrolyse. C’est pourquoi nous allons procéder à une hydrolyse partielle ou ménagée. Pour cela nous aurons recours au phénylméthylsulfonyl-fluoride (PMSF) qui est un inhibiteur des protéases à sérine, afin de pouvoir inhiber l’action de l’α-chymotrypsine après l’avoir laisser réagir avec notre peptide. Ensuite, pour être sûr qu’elle n’hydrolyse plus, nous allons la dénaturer par la température et en présence d’un agent réducteur, le dithiothréitol (DTT) qui coupe les ponts disulfures présents dans la structure de cette enzyme afin que son site catalytique soit désactivé.

La séquence de notre peptide est celle-ci : AVELRSPGISRFRRKIAKRSIKTLEHKRENAKE

En étudiant la séquence en acides aminés du peptide, il est déjà possible de prédire les résultats que nous allons obtenir : la séquence du peptide présente un seul acide aminé aromatique, la phénylalanine (F) en position 12. L’enzyme va donc hydrolyser le peptide en deux morceaux : un premier comportant 12 acides aminés, et un deuxième comportant le reste soit 21 acides aminés. Nous allons donc obtenir 2 pics distinctifs sur le chromatogramme de l’injection du peptide hydrolysé.

Pour pouvoir étudier notre peptide, il est nécessaire au préalable de faire une injection “blanche”, c’est-à-dire une injection sans peptide avec seulement de l’eau et du tampon. C’est une injection témoin qui va nous permettre de détecter des pics artéfactuels, ou dits “fantômes” (impuretés du tampon, du ou des solvants, de la colonne…) et que l’on pourrait supposément retrouver sur le chromatogramme d’intérêt, et s’il y a détection de pics, reporter les temps de rétention trouvés sur le chromatogramme du peptide digéré pour différencier ce qui nous intéresse.

Ensuite, il faut faire une injection de notre peptide d’intérêt non digéré. Cette étape va nous permettre de relever le temps de rétention du peptide entier, puis sur le chromatogramme du peptide digéré de voir si le pic spécifique est encore présent, afin de juger si l’hydrolyse s’est produite.

Afin de pouvoir comparer les différents chromatogrammes, il est nécessaire de trouver une échelle de sensibilité, celle-ci correspondant à l’axe des ordonnés, qui sera commune à chacun. Pour cela, on utilise le logiciel Offline, on se réfère au chromatogramme du peptide digéré car ce sont les sous-peptides obtenus qui nous intéressent, on prend ainsi en compte les deux pics obtenus après la digestion. On se réfère donc au chromatogramme du peptide non digéré. Afin de bien visualiser les pics obtenus, nous avons fixé l’échelle de sensibilité avec un delta de 100. Celle-ci sera appliquée à tous les autres chromatogrammes pour valider les résultats.

Voici ci-dessous les chromatogrammes obtenus dans l’ordre de leurs prises :

- 1er chromatogramme : injection « blanche »[pic 1]

- Sur le chromatogramme de l’injection blanche, c’est-à-dire le tampon NaCl 0,15 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, nous pouvons voir qu’il n’y a q’un seul pic bien distinct correspondant à l’injection, et significativement pas de pics fantômes, donc pas d’impuretés dans l’appareillage : dès lors, tous les pics présents dans les chromatogrammes suivants seront donc issus des produits de notre expérience.

- 2ème chromatogramme : injection du peptide non digéré

[pic 2]

- Sur le chromatogramme correspondant à l’injection du peptide entier non hydrolysé, nous pouvons constater la présence majoritaire d’un pic aux alentours de 9 minutes. Ce pic correspond à la totalité du peptide dans sa conformation native. On sait donc maintenant que le temps de rétention du peptide entier est de 9 minutes, nous pourrons donc nous référer à ce temps de rétention pour les autres chromatogrammes afin d’identifier les pics. Les autres petits pics présents ne viennent pas du tampon (blanc), donc ce sont des pics venant sûrement du peptide commercial, présentant des conservateurs.

- 3ème chromatogramme : injection du peptide après traitement par l’α-chymotrypsine

[pic 3]

- Sur le chromatogramme de l’injection du peptide après hydrolyse, nous pouvons voir plusieurs pics. Le premier est dû à l’injection et représente la sortie des molécules polaires n’ayant pas adhéré à la phase stationnaire apolaire : on peut notamment citer le DTT et le tampon Tris-HCl. Le pic suivant représente le PMSF dissous dans le méthanol, un solvant polaire qui de ce fait ne va pas être retenu. Le fait que le PMSF ne sorte pas dans le premier pic avec les autres composés polaires s’explique par le fait que cette molécule présente un cycle aromatique dans sa structure, la rendant légèrement apolaire, et sera donc un peu plus retenue que les autres.

On va s’intéresser aux pics significatifs suivants du chromatogramme, le premier ayant un Tr aux alentours de 5,30 minutes et le deuxième aux alentours de 7,40 minutes. Il y a aussi un pic beaucoup plus petit, présent aux alentours de 9 minutes, et correspondant donc à la présence de notre peptide non digéré mais en plus petite quantité. En effet, son pic est environ 5 fois plus petit qu’avec le chromatogramme non digéré. Cela signifie qu’il a bien été hydrolysé par l’α-chymotrypsine, mais qu’il reste des traces de ce même peptide encore entier.

Les deux pics présents en amont du peptide non digéré encore présent correspondent donc à nos 2 morceaux de peptides clivés par l’α-chymotrypsine. Pour déduire quel pic correspond à quel sous-peptide, il faut se pencher sur leurs compositions. On rappelle que les acides aminés polaires sont : C (Cys), Y (Tyr), S (Ser), T (Thr), N (Asn) et Q (Gln).

- AVELRSPGISRF : Ce premier sous-peptide 1 comporte 2 acides aminés polaires.

- RRKIAKRSIKTLEHKRENAKE : Ce deuxième sous-peptide 2 comporte 3 acides aminés polaires, donc cette structure est plus polaire que la structure précédente.

Dès lors, puisque l’on sait que l’HPLC en phase inverse retient les composés d’autant plus longtemps sur la phase stationnaire que leur polarité est faible, on peut déduire que le premier pic significatif du chromatogramme correspond au sous-peptide 2, plus polaire que le premier et