TP - Gel SDS-PAGE

TP5: SDS-PAGE

Introduction

Le SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide) est une technique de gel d’électrophorèse. Cette technique consiste à faire migrer des protéines dans un gel, grâce à un courant électrique, afin de les séparer en fonction de leur masse moléculaire.

Lors d’un précédent TP, la sérumalbumine bovine (SAB, Mr= 66,0kDa) et le cytochrome c (12,4kDa) ont été séparées par chromatographie d’exclusion sur gel de Séphadex, en fonction de leur tailles.

Objectif

Cette manipulation aura pour but d’étudier le principe de la séparation des protéines en fonction de leur masse moléculaire lors d’une électrophorèse, sur gel de polyacrylamide, en conditions dénaturantes. Il sera alors ainsi possible de savoir si la séparation de la SAB et du cytochrome c, par chromatographie d’exclusion a été préalablement correctement réalisée.

Partie 1: Matériels et méthodes

Le matériel nécessaire est une cuve à électrophorèse, un générateur de courant, un gel de polyacrylamide, une solution de tampon, et des échantillons protéiques.

La cuve à électrophorèse a été montée de telle sorte à pouvoir couler le gel entre les 2 plaques.

I. Préparation des gels

Deux gels ont dû être préparés. Le premier est le gel de dépôt, le second le gel de ... Ces gels sont composés des mêmes solutions mais dans des concentrations différentes, hormis le tampon qui diffère.

A. Gel de séparation

D’abord, une solution de polyacrylamide à 12% (soit 1,5 mL de la solution initiale à 40%) a été déposée dans un bécher. Le gel de polyacrylamide est réalisé grâce à la polymérisation d’acrylamide (CH2 = CH -CO-NH2) et de bis-acrylamide (CH2 = CH-CO- NH - CH2 - NH - CO- CH = CH2). Ce gel peut être représenté par un tamis dont les mailles sont déterminées par la variation de tailles des molécules d’acrylamide. En effet, plus la concentration en acrylamide est élevée, alors plus les pores seront petits, freinant ainsi la progression des molécules des échantillons dans le gel.

Ensuite, le tampon de séparation G1 (1X) a été rajouté à partir d’une solution de tampon G 4X (prélèvement de 1,25mL). Ce dernier est composé de Tris-HCl à 1,5M, SDS à 0,4% à un pH de 8,8. Le Tris- HCl (Tris-hydrochloride) est un tampon efficace avec un pH compris entre 7,0 et 9,2, avec un pKa de 7,8 (à 20°C) Ce qui explique le pH du tampon G. Quant au sodium duodecyl sulfate (SDS), c’est un détergent anionique fort, possédant une longue queue hydrocarbonée hydrophobe et une extrémité chargée négativement. Il est capable de venir se fixer sur la périphérie des chaines protéiques, leur conférant ainsi une charge négative. Le protéines sont alors dénaturées car le SDS empêche leur repliement, entrainant la

1 https://www.ladissertation.com/Sciences-et-Technologies/Sciences-Cognitives/Compte-Rendu-TP-%C3%A9lectrophor%C3%A8se-De- Prot%C3%A9ines-163609.html

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perte de la structure tridimensionnelle. Les protéines, étant toutes chargées négativement, migreront vers l’anode. Seul le poids moléculaire sera à l’origine de la séparation des protéines.

Le persulfate d’ammonium (NH4)2S2O8) 10% est rajouté (25uL). Sous forme de poudre, l’ammonium persulfate a dû être dilué dans 1ml d’eau pour 0,1g de poudre. Cette oxydant fort est capable de produire des radicaux libres et entraîner des réactions de polymérisation. LEs radicaux libres de persulfate vont convertir les monomères d’acrylamide en radicaux libres qui vont réagir avec les monomères non activés. Ainsi débute la réaction en chaine de polymérisation. C’est un initiateur de polymérisation. Afin de diluer les solutions, de l’eau est rajoutée (2,22mL).

Afin de couler rapidement, les opérations suivantes se font le plus rapidement possible, afin d’éviter la polymérimération du gel avant que ce dernier ne soit coulé. Le TEMED (Tétraméthyléthylènediamine) a été injecté dans les solutions préalablement préparées (5 uL). Le TEMED, utilisé avec le persulfate d’ammonium, permet de catalyser la polymérisation de l’acrylamide. En effet, il accélère la formation de radicaux libres à partir de persulfate d’ammonium, qui va également catalyser la polymérisation. Un pont de bis-acrylamide est alors formé entre deux chaines linéaires d’acrylamide. C’est donc un accélérateur de polymérisation.

Figure 1: Formation d’un pont bis-acrylamide par l’action du TEMED

Après avoir mélangé, le futur gel est prélevé et coulé entre les deux plaques. Afin d’éliminer les bulles, de l’isosulfate a été rajouté entre ces plaques.

Le gel de séparation est moins acide que le gel de concentration. Les mailles sont plus petites étant donné qu’il est fortement concentré en polyacrylamide. Ce gel joue le rôle de tamis, en ralentissant les protéines les plus grosses.

B. Le gel de concentration

Ce gel a été réalisé en mélangeant une solution de polyacrylamide à 5% (0,75mL), un tampon de concentration H 1X (à partir d’un tampon initiale 4X) (1,50mL), le persulfate d’ammonium à 10% (15uL), l’eau (3,73mL) et enfin le TEMED (5uL). Le tampon de concentration H est composé de Tris HCl à 1,5M, de SDS à 0,4% à pH de 6,8.

Le gel a dû être coulé de telle sorte à ne pas faire de bulles à sa surface, afin de ne pas abimer les trous de dépôt. Le peigne fut rajouté afin de créer ces trous de dépôts.

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Le gel de concentration est peu concentré et possède des mailles larges. A un pH de 6,8, les ions chlorures seront alors chargés et vont permettre, sous l’action du champ électrique de concentrer les protéines en une bande fine.

II. Préparation des échantillons

4 solutions protéiques ont été préparées dans des tubes eppendorfs. La première contient 5uL de marqueurs de masse moléculaire, permettant par la suite, à la détermination du poids moléculaires des protéines présentes dans les autres solutions. Les marqueurs présents sont les suivants: β galactosidase (116 kDa), l’albumine (66,2kDa), l’ovalbumine (45kDa), anhydrase carbonique (35kDa), cytochrome