Clonage moléculaire de l'ADN

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Il a été ici choisi d'utiliser un plasmide de petite taille, nommé pBlueScript ou pBS.

Ce plasmide est un chromosome circulaire bactérien double brin provenant d’E.coli dont la réplication est indépendante de celle du chromosome de la bactérie. Ce plasmide de petite taille (entre 2 et-5kb ) fut créé chimiquement en laboratoire de façon à contenir deux gènes. L’un de ces gène est un gène de résistance à l'ampicilline, un antibiotique, noté ampR. L’autre gène, lacZ, code pour la β-galactosidase, une enzyme qui catalyse l’hydrolyse du lactose.

Ce plasmide contient également un site polylinker, petit fragment nucléotidique double brin contenant plusieurs sites de restrictions différents les uns des autres, n’existant pas dans le vecteur. (figure 1)

Cartographie de sites de restriction par les enzymes de restriction :

Pour connaître le nombre de produits de digestions par les enzymes de restrictions, une carte de restriction de l'ADN du phage et du

plasmide doit être réalisée.

Une carte de restriction est une carte physique d’un fragment d’ADN réalisée par le positionnement de divers repères sur sa séquence par des enzymes de restriction.

Le nombre de sites de restriction -c'est à dire la taille des fragments - par chacune des deux enzymes est compté et la taille de chacun de ces fragments produits est calculée. Cela permettra, lors de l’électrophorèse d'identifier chaque fragment relativement à un autre (figure 2).

Ligature de deux fragments d'ADN (ou inserts)

Les brins d'ADN digérés auparavant peuvent être reliés par l'action d'une enzyme, la ligase (une « colle moléculaire »), qui agit à température ambiante. Cette enzyme est capable de former une liaison phosphodiester entre l’extrémité 5’ terminale d’un brin d’ADN et l’extrémité 3’OH d’un autre brin.

Afin que la ligation s’effectue correctement, les enzymes de restrictions doivent être inactivées. Elles sont donc placées dans un bain marie à 70°C pendant 10 minutes. A cette température, la structure des enzymes est fortement modifiée, ce qui les dénature.

La ligase d’E.coli ne pouvant souder que deux extrémités cohésives compatibles, le plasmide et l’ADN du phage λ doivent être exposés aux mêmes enzymes de restriction. De cette façon, nous nous assurons d’orienter les deux brins, chacun possédant deux extrémités, chacune étant coupée par une enzyme de

restriction différente.

A noter : il existe d’autres ligases comme T4DNA capables de lier des bouts francs.

On mélange les fragments d’ADN avec le plasmide coupé.

Les extrémités cohésives du plasmide étant orientées, elles vont s’associer par appariement des bases avec les extrémités cohésives complémentaires du fragment d’ADN qui nous intéresse.

Elles sont donc liés entre le site HindIII et le site EcoRI du plasmide pBlueScript

précédemment linéarisé

NB : une multitude d’autre combinaisons est possible : les plasmides non recombinés peuvent se reformer ; d’autres plasmides peuvent être formés de

plusieurs fragments d’ADN).

Puis, des liaisons covalentes sont établies entre les molécules d’ADN à l’aide d’une enzyme : l’ADN ligase.

Analyse par Electrophorèse sur gel d'agarose des fragments d'ADN à l’issue de la digestion :

Cette technique de séparation des acides nucléiques, inventée en 1933 par A. Tiselius est extrêmement utilisée en biologie moléculaire.

Elle permet de séparer les fragments d’ADN en fonction de leur taille par électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide.

Le gel de polyacrylamide est plutôt utilisé pour séparer (par migration verticale) des petits fragments d’ADN (

Le pouvoir de résolution du gel de polyacrylamide est supérieur à celui du gel d’agarose.

Dans notre cas, les échantillons à analyser sont déposés dans des puits séparés, ici sur une plaque de gel d'agarose 1%.

Un des puits de dépôt contient des fragments d’ADN de tailles connues, servant de marqueur de taille.

Ce fragment de taille va nous permettre de déterminer la taille des fragments obtenus à l'issue de la digestion et nous assurer de la conformité de ses résultats.

On a préalablement ajouté dans les dépôts deux colorants :

- du bleu de méthylène (tampon bleu de charge contenant du glycérol) qui va migrer très rapidement avant les fragments d’ADN (car plus dense) pour visualiser le front de migration.

Ce colorant bleu dans le tampon de charge se comporte pendant la migration comme une molécule d'ADN de taille d'environ 500 nucléotides. Ainsi, sa position nous permettra de visualiser l'évolution de la migration : si les fragments d'ADN sont de taille suppérieure à 500 nucléotides, ils seront en arrière de la zone bleu dans le gel.

- et du bromure d’éthidium (BET), un agent intercalent qui se fixe spécifiquement entre les bases de l’ADN, pour émettre une fluorescence rouge-orangée lorsque l’on examine le gel sous lumière ultraviolette à 254 nm.

Au cours de la migration électrophorétique, l’ADN se charge donc en BET, et devient lui aussi fluorescent. Cela permet de visualiser les bandes et éventuellement de photographier les fragments d’ADN digérés.

Une tension (ou champ électrique) est ensuite appliquée au travers du gel, qui est constitué d’un réseau microscopique de pores, formant un maillage.

Parce qu’il est chargé négativement à pH 7, dû à ces groupements phosphate, l’ADN migre vers l’électrode positive, ou anode.

(figure ci-contre)

Deux paramètres permettent de séparer des fragments d’ADN : la taille : plus un fragment est grand, plus il sera retenu dans les mailles du gel, donc il