Tp Trypsine

Travaux Pratique 5 : Etude cinétique de la trypsine

But :

Le but de ce travaux pratique est d’étudier les paramètres cinétiques d'une protéase, la trypsine . Lors de cette manipulation nous réalisons une hydrolyse enzymatique. Puis nous suivons la réaction enzymatique a l'aide d'un dosage spectrophotométrique des produits apparus dans le milieu.

Principe :

L'Hydrolyse enzymatique :

La trypsine est une protéase digestive, elle catalyse l'hydrolyse des liaisons peptidiques du coté C-terminal de la lysine et de l'arginine qui sont deux acides animes basiques. Pour ce travaux pratique nous utilisons le substrat synthétique chlorhydrate de benzyloxycarbonyl-para- nitroanile ( Z-Arg-p-NA,HCL), en présence de l'enzyme, le substrat se fixe sur le site actif de l'enzyme ainsi nous avons un complexe enzyme-substrat. Ensuite, hydrolyse des liaisons peptidiques peut avoir lieu ( rf réaction chimique schéma ). Le produit de cette réaction est la p-nitroanline,  qui donne une couleur jaune et qui peut être dosée spectrophotométriquement a  410nm.

Le principe de la mesure d 'une activité enzymatique :

L’activité enzymatique se mesure par la vitesse de la réaction de transformation du substrat S en produit.

E+S → ( deux flèches )ES → E+P

Il est possible d'estimer la vitesse de la réaction de deux manières :

• soit en mesurant la vitesse de la disparition du substrat – d[S]/dt
• soit en mesurant la vitesse d'apparition du produit d[P]/dt

Pour cette manipulation nous avons choisit la deuxième méthode, car elle est plus adaptée pour mesurer la vitesse initiale de la réaction , a t=0 nous avons une quantité négligeable de produit.

Pourquoi nous utilisons la spectrophotométrie d’absorption?

Nous souhaitons d'enregistrer en continu l'augmentation d'absorbance en fonction du temps. Le substrat n'absorbe pas a une longueur d'onde donnée alors que le produit absorbe. D’après le spectre d'absorption le pic maximal du produit est à 380 nm or à cette longueur d’onde le substrat est toujours présent (jusqu’à 400 nm). C’est pourquoi nous choisissons 410 nm pour avoir que le produit.

Quel est le principe du dosage spectrophotométrique ?

C'est une méthode qualitative qui consiste a mesurer l'absorbance d'une solution colorée au cours du temps dans le but de déterminer sa concentration. En effet l'absorbance et la concentration sont reliées par la lois de Beer Lambert :    

[pic 1]

Le spectrophotomètre est relié a un ordinateur avec un logiciel qui nous permet d'observer la variation d'absorbance dans un intervalle de temps ( varie entre 1-10 selon les expériences ), cela nous permet de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique ( deltaA/min).

Quelques notions enzymatique :

Une enzyme : Une enzyme est une protéine capable de catalyser une réaction spécifique. En effet, le substrat se fixe sur l’enzyme afin de se transformer en produit. L’enzyme a pour rôle de diminuer l’énergie d’activation et donc accélère la réaction qu’elle catalyse.

La vitesse : La vitesse d’une réaction se traduit par soit l’apparition du produit au cours du temps soit la disparition du substrat au cours du temps. Elle s’exprime en umol.min-1 et peut se calculer à tout instant de la réaction.

La vitesse initiale : La vitesse mesure lorsque la réaction enzymatique n’a pas encore eu le lieu, le système contient uniquement le substrat et il y a pas encore de produit formé. Cette vitesse se calcule au début de la réaction. T=0

La vitesse initiale maximale théorique Vm : C’est la vitesse maximale théorique que pourrait atteindre l’enzyme pour une concentration infinie de substrat [E]<<<[S]

Km = constante de Michaelis

Km est égale à la concentration du substrat pour laquelle la vitesse est la moitié de la vitesse maximale. Elle permet de mesurer l’affinité de l'enzyme pour le substrat.

Km ↑ affinité ↓

Km ↓ affinité ↑

Kcat = constante catalytique

il se traduit par le nombre de molécule de substrat convertir en produits par unité de temps ,par chaque site actif.

Résultat :

Préparation de 50mL de solution de Z-Arg-p-NA 2mmol/L

Ci= 200mmol.L

Vi= ? mL

Cf=2mmol/L

Vf=50mL

Vi= (Cf x Vf )/ Ci= 0,5 mL