Technique d'isolation des protéines
Par Andrea • 8 Juillet 2018 • 4 690 Mots (19 Pages) • 648 Vues
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Sédimentation :
La sédimentation se fait en superposions respectivement, des gros molécules et puis des petites molécules, leur vitesse varient selon la taille de la molécule.
- La vitesse avec laquelle une particule sédimente dans une ultracentrifugeuse dépend de sa masse.
C-Dosage des protéines
- spectrophotométrie
- Spectrophotométrie UV-visible
La spectrophotométrie est une technique qui consiste à mesurer à l’aide d’un appareil, spectrophotomètre, l’absorbance d’une solution à une longueur d’onde donnée. On distingue un soluté coloré qui absorbe la lumière visible à des longueurs comprises entre 400-800 nm d’où l’appellation des spectrophotocolorimétrie et certaines solutés qui absorbent dans l’ultraviolet (UV) (longueur d’onde
- Principe
La spectrophotométrie d’absorption sert à mesurer l’atténuation de la lumière qui traverse un milieu pour trouver les concentrations des substances absorbantes (chromophores). Voir figur…..
-A=280nm ne peut être utilisée pour fins d’analyse quantitative sans posséder une information supplémentaire puisque la composition des acides aminé varie d’une protéine à une autre. C’est-à-dire, des variations dans la composition des acides aminés donnent des absorptivités molaires (ε280nm) qui varient d’une protéine à une autre.
La quantification des protéines dans un mélange isolé des cellules à l’aide de l’absorption UV-visible s’avère difficile car la compostions des protéines et leurs coefficients d’absorption ne sont pas connus.
2- Mesure colorimétrique
La colorimétrie est une méthode qui relie la perception de couleur aux mesures physiques .
Il existe trois méthodes de dosage colorimétrique les plus connue et qui permettent de déterminer la concentration des protéines.
Il ya la méthode de biuret qui utilise le réactif de gornall qui est composé d’ions cuivre II (cu2+) et forme un complexe bleu-violet avec les liaisons peptidiques à une absorption maximale de 540-550nm dans un milieu alcalin.
Il ya aussi la méthode de Bradford qui utilise comme réactif le bleu de coomassie qui se lie avec les acide amines basique et aromatiques pour donner une couleur bleue dans un milieu acide et possède un spectre d’absorption maximal égale a 595nm mais lorsque le bleu de coomassie est libère la coloration rouges et marron et il a une absorbance de 465-470-nm, le changement de l’absorbance est proportionnelle à la quantité de coloration
Et enfin il ya la méthode de Lowry qui est complémentaire a celle de biuret. En effet les protéines réagissent tout d’abord dans un milieu alcalin avec le réactif de Gornall puis un autre réactif dit réactif de folin-ciocalteu (phosphotungstomolybdique) est ajouté.
Ce dernier est compose d’un mélange de tungstate de sodium et de molybdate de sodium en solution dans de l’acide phosphorique et de l’acide chlorhydrique qui ont pour rôle de permettre la réduction des acide aminés aromatique (tyrosine et tryptophane) ce qui va causer la formation d’un complexe de couleur bleue foncée dont on mesure l’absorbance entre 650 et 750nm
- Séparation et purification des protéines
- Chromatographie
PRINCIPE GENERAL
La chromatographie est un terme qui recouvre une large gamme de techniques qui permettent la séparation des constituants d'un mélange en phase liquide ou gazeuse. Les molécules à séparer sont entrainées par un fluide liquide ou gaz appelé phase mobile. Elles interagissent (ou pas) avec un support fixe (solide ou liquide fixé) qui représente la phase stationnaire. Les différents constituants du mélange se déplacent donc à des vitesses différentes : La séparation et le temps de migration des composés à séparer dépendent des différences d'affinités de ces composés pour les phases mobile et stationnaire. Il y a différentes types des chromatographies :
1-La chromatographie sur une couche mince(CCM)
La chromatographie sur une couche mince est une méthode très simple. Elle est aussi utilisée pour séparer et analyser un mélange . Elle regroupe deux phases : La phase stationnaire solide fixée sur plaque et la phase mobile liquide (l’éluant) qui est un solvant u un mélange de solvant ; elle consiste en effet à dépasser le mélange à séparer dans une phase une stationnaire que l’on met au contact de la phase mobile. Les constituants du mélange à analyser sont donc entraines de bas en haut le long de la phase fixe par la phase mobile : C’est le phénomène d’élution celui-ci permet de séparer des constituant du mélange à analyser.
Chaque substance migre s’arrête à une certaine hauteur ; caractéristique de la substance ; dénommée rapport frontal ou rétention frontal(Rf)
Rf=Hauteur de la tache/Hauteur du front du solvant
Sur la phase fixe les taches correspondant à chaque constituant sont identifies par comparaison du Rf avec un témoin
2-Chromatographie sur colonne
La chromatographie sur colonne est une méthode a visée séparative des constituants d’un mélange par migration dans un dispositif renfermant deux phases :
-phase stationnaire (support solide)
-phase mobile (le solvant)
Elle consiste a séparer un groupe des protéines en des nombreux petits groupes dont certains sont enrichis avec la protéine d intérêt .Il existe différents types de chromatographie sur colonne telles que : la chromatographie par affinité , chromatographie d’échange d’ions
La plupart des systèmes de purification font recours à l’utilisation de plusieurs types de protéines des chromatographies précédemment cites .En effet une bonne optimisation d’une méthode de purification réside dans les choix de la /les méthode(s) chromatographie (s) la /les plus approprie(s).
- Chromatographie d’affinité
La chromatographie est la méthode
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