Les enzymes

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/GATC : MboI (Moraxella bovis)

Sau3A (Staphylococcus aureus 3A)

GAGCT/C : SacI (Streptomyces achromogenes)

Sst1 (Streptomyces stanford)

ou des coupures différentes :

Sma1 (Serratia marcescens) : CCC/GGG

XmaI (Xanthomonas malvacaerum) : C/CCGGG

Pour associer 2 fragments d’ADN digérés par des enzymes de restriction il faut:

• créer les liaisons covalentes phosphodiester associant une extrémité 3’OH et une

extrémité 5’P entre des nucléotides adjacents, au sein d’une séquence d’ADN parfaitement

bicaténaire.

• de l’énergie apportée par l’ATP.

[pic 5]

Les extrémités doivent être compatibles. Si ça n’est pas le cas, il faut les modifier!!!

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Les phosphatases et kinases

Ce sont des enzymes de modifications qui permettent de modifier des séquences ou des extrémités générées par les enzymes de restriction.

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Phosphatase alcaline

L’activité phosphatase correspond à l’élimination des groupements 5’ P des acides nucléiques. Son utilisation principale est pour le clonage afin éviter la recircularisation du vecteur sur lui-même.

Utilisation principale : clonage

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Polynucléotide Kinase

Activité kinase = Transfert d’un groupements phosphate de l’ATP sur la terminaison 5’-hydroxyle d’un polynucléotide (ADN et ARN)

Utile pour le marquage des extrémités[pic 6]

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Applications

Plasmide recombinant : plasmide, vecteur, qui aura intégré un insert. On vérifie sur gel d'agarose après digestion de l'enzyme (par l'enzyme qui a servi au clonage). On obtient alors l'insert + le vecteur.

On peut obtenir sur le gel deux types de profil :

- deux bandes (plasmide + insert)

- une grosse bande intense et juste en dessous une toute petite. La bande intense est un peu au-dessus de celle d'à côté (plasmide circulaire → ça a pas marché).

On fait agir la phosphatase sur le plasmide (et non sur l'insert) :

→ Une fois recombinés, il y a des liaisons hydrogènes et les régions phosphodiester qui se reforment sauf qu'il manque deux phosphates aux extrémités du plasmide. Donc deux liaisons phosphodiester ne peuvent pas se faire in vitro.

Mais quand on passe dans la bactérie, ces deux fonctions phosphodiester se reforment et on peut avoir un vrai plasmide recombinant double brin grâce à des kinases.

[pic 7]

[pic 8]

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Les polymérases

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ADN polymérases

L'ADN polymérase est une enzyme qui va synthétiser de l'ADN : élongation dans le sens 5’ -> 3’.

Pour fonctionner, ces enzymes ont besoin :

- D’une amorce ADN

- D’une matrice ADN : la polymérase agit pour passer d'une structure simple brin à une structure double brin grâce au brin matrice (elle synthétise le brin complémentaire). Il lui faut s'accrocher sur une extrémité 3'OH libre

- Des dNTP (nucléotides)

- D’ions

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ADN polymérase I : ADN pol I (E.coli)

ADN pol I possède 3 activités enzymatiques différentes :

- Polymérase de 5’ vers 3’ = Activité majeure

- Exonucléase de 5’ vers 3’ (Réparation, élimination amorces)

- Exonucléase de 3’ vers 5’ (Correstion d’épreuve ou « proof reading »)

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Fragment de Klenow (issus de l’ADN pol I)

Ce fragment provient d’une protéolyse de l'ADN Pol I : 109kDa → 76 kDa + 36 kDa

Les 76kDa correspondent en fragment de Klenow.

Il possède 2 activités :

- Polymérase de 5' vers 3' = Activité majeure

- Exonucléase de 3' vers 5'

Ce fragment est utilisé dans de nombreuses applications.

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ADN polymérase du phage T4

Elle possède les mêmes activités que le fragment de Klenow mais l'activité exonucléase 3' → 5' est plus importante que celle du fragment de Klenow.

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Autres enzymes utiles

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ARN polymérases

Elles permettent la synthèse de 5' vers 3' de transcrits à partir :

- D'une matrice ADN

- Des 4dNTP

- D'ions Mg2+ - (pas besoin d'amorce).

Exemple :

- ARN polymérase du phage SP6 : synthèse