Colonne Chromatographie

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Supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d’affinités :

→ polyosides : celluloses, billes d’agarose (sepharose, pharmacia)

Grande porosité, avec de nombreux groupements fonctionnelles capables de lier les ligands (petites mol biologiques spécifiques) par covalences.

→ Agarose (nombreux groupements hydroxyl libres) = le plus utilisé

Il existe des supports d’agarose (sepharose) activés pour le couplage covalent du ligand, avec éventuellement un bras espaceur entre la matrice et le ligand : fixation de ligands contenant des groupes aminés (NH2), carboxyl (-COOH), hydoxyl (-OH), ou thiol (-SH)

Les macromolécules sont séparées suivant leur propriété biologique

(Récupéré la protéine : Rajouté concentration élevé du ligand libre)

CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS

→ dextrane (sephadex)

→ agarose (sepharose)

→ cellulose

Macromolécule séparés suivant leurs charges

Séparation de molécules chargés, la charges des mol dépendant du PH de la solution

Support (résine) sur lequel sont fixés des groupements chargés capables d’établir des interactions ioniques avec des ions de charges opposées :

- résine échageuse de cations (chargé -)

- résine echageuse de anions ( chargé +)

Support les plus courant :

Polyosides : cellulose (sephacel, billes) / dextranes (sephadex) / agarose ( sepharose, bio-Gel A)

Cellulose = polymère linéaire de D-GLC liés en β -(1-4) = répétition de cellobiose. [pic 11][pic 12][pic 13]

Chromatographie sur Couches Minces

→ Acétate de cellulose

chromato d’adsorption et/ ou de partage,

Séparation des composées selon leur polarité :

- les plus polaires sont retenues par la phase fixe polaire

- les moins polaires migrent plus car sont entrainés avec la phase mobile (solvant)

Applications :

CCM en industrie pharmaceutiques :

Contrôle de qualité : identification de composés, essaie de pureté d’un médicament

CCM en industrie agro-alimentaire :

….

Dosages des polyphosphates dans des produits de la mer (poissons, crustacés et céphalopodes)

→ Par chromatographie sur couches mince et photodensitométrie

Polyphosphates = familles d’additifs à rôle émulsifiant, rétenteur d’eau ou cryoprotecteur limités par la réglementation à 5g/kg (produits de la mer congelés ou surgelés)

ELECTROPHORÈSE

→Acétate de cellulose

→ gel d’agarose

l’électrophorèse consiste en la migration de molécules chargées lorsqu’elles sont placées dans un champs électriques

- les anions (chargés -) migrent vers l’anode (pôle +)

- les cations (chargé +) migrent vers la cathode (pôle -)

Séparation des acides nucléiques, des protéines..

Support d’électrophorèse : polymère finement réticulé qui forme un réseau à mailles de taille variable

Polyamide :

- Acétate de cellulose

- Agarose (gel)

Ou autre : polyacrylamide (gel) mais pas une biomolécule.

→Electrophorèse sur papier ou sur acétate de celluose

Acétate de celluose :

- feuille mince d’un dérivé acétate d’une forme purifié de cellulose

- sert beaucoup pour séparer grossièrement des protéines

- faible résolution : sépration de grands groupes de protéines

- utiles pour la séparation des protéines sériques (bioch cliniques,) mais tend à être remplacé par matrice d’agarose

→Electrophorèse sur gel d’agarose

Agarose :

- très hydrophile

- frome des gels solides mais très poreux, même à très basse concentration (1%)

- ne polymérise pas par création de liens covalents : se gélifie à basse T°, par formation d’une multitude de liaisons hydrogène

- agarose = tamis moléculaire : larges pores adaptés à la séparation des molécules de grande taille

- peut utiliser dans le cas des protéines (plutôt gels de polyacrylamide)

Électrophorèse sur gel d’agarose :

- séparation de fragments d’acides nucléiques en fonction de la taille : les charges – des groupements phosphate orientent la migration de l’ADN vers l’anode

- visualisation des acides nucléiques grâce à un colorant approprié (bromure d’éthydium permettant de visualiser les fragment ADN sous la lumière UV)

Utilisations : → Souvent pour l’électrophorèse des acides nucléiques

- traçabilité et contrôle qualité des p° alimentaires (OGM)

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