Dosage du calcium total dans le sérum

Dosage du calcium total dans le sérum

Principe de la réaction :

Sérum [pic 1]

                                           pH alcalin

Calcium + bleu de methylthymol                         Complexe bleu spécifique détectable à 612nm[pic 2]

Matériel :

Solution « stock dye » : pour 100mL de solution

• 18mg Bleu de Méthylthymol 12M : indicateur acide/base → nécessite l’utilisation d’un tampon
• 0,72g 8-quinolinol : crée un complexe avec le magnésium pour éviter la liaison de ce dernier au bleu de méthylthymol, ce qui entrainerait la détection de calcium et de magnésium.
• 1mL d’acide chlorhydrique : Acidifie le milieu afin de compenser le tampon très alcalin et obtenir un pH entre 11,5 et 12,5
• 0,6g de PVP : il se fixe au Bleu d Méthylthymol afin d’empêcher la fixation des protéines du sérum.
• Eau milliQ qsp 100mL : eau distillé contient Calcium qui serais alors doser avec le sérum du patient. Il faut obligatoirement utiliser de l’eau milliQ !!

Solution « stock base » : pour 100mL de solution

• 2,4 g de sulfite de sodium : réducteur, empêche l’oxydation du bleu de méthylthymol par dissolution de l’oxygène → stabilise la couleur du complexe bleu-calcium pendant 12h.
• 22mL de monoéthanolamine : Tampon pH alcalin → nécessaire au Bleu de Méthylthymol.

Sérum :

• 10 sérums de patients de concentrations inconnues
• CIQ1 de C°interne=1.80mM et C°externalisée=1.81mM
• CIQ2 de C°interne=2.40mM et C°externalisée=2.42mM
• Sérum étalon calcium Cétalon= 1.35mM

Méthode :

Préparation du Réactif de travail : ne préparer que le volume nécessaire à la manip en cours, cette solution ne se conserve pas plus de 6h (cf. Etude de stabilisation).

Dans ce TP, nous effectuons 40 dosages par étudiants, donc 80 par binôme, il faut 1mL de réactif par dosage : on prépare donc 90mL de réactif de travail

• Mélanger volume à volume (45mL/45mL) les solutions « stock dye » et « stock base » dans une éprouvette graduée.
• Vérifier le pH de la solution, il doit être compris en 11,5 et 12,5. Si pH trop acide, on rajoute du NaOH, si pH trop basique, on rajoute de l’acide Chlorhydrique.
• Réserver au réfrigérateur afin de prévenir les effets dus au changement de température.

Protocole de la Méthode :

• Déterminer au spectromètre la longueur d’onde du pic d’absorbance du bleu.
• Faire le blanc et mesurer l’absorbance des échantillons à la longueur d’onde de ce pic.

Calcul de la concentration en calcium total dans le plasma :

[pic 3]

[pic 4]

Protocole du Kit :

• Mesurer l’absorbance à 575nm

Calcul de la concentration en calcium total dans le plasma (mg/dl):

[pic 5]

[pic 6]

Stabilité des réactifs :

La stabilité des solutions (stock base, stock dye, travail) ont été testées à l’aide d’un étalon de 3.40mM de calcium.

Pour cela, la concentration en calcium est dosée sur une durée de 3 mois avec :

- une solution de travail préparée à partir des solutions stocks en début d'étude et conservée toute la durée de l'étude