Les ARN Catalytiques

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Les parties d'introns associés aux exons sont appelées : IGS (Internal Guide Science). Ce sont des séquences introniques associées aux exons, pas nécessaires à l'activité de l'intron.

Ces tiges sont formées par des appariements classique : G-C et A-U.

P4 est formée en partie par l'appariement des motifs P et Q.

La structure P7 est la structure la mieux conservée dans tous les IG1 ; elle s'étend sur 6 pb, un nucléotide saillant n'est associé à aucun nucléotide. A l'intérieur, on trouve une paire de base G-C qui est présente universellement dans tous les IG1.

Les tiges sont observées dans toutes les régions. Les tiges P2 à P10 ne sont pas universelles.

Les structures nécessaires à l'activité enzymatique = les structures secondaires. Autrement dit, l'activité catalytique des IG1 est conditionnée par l'existence des structures secondaires.

[pic 2]

- Analyses phylogénétiques et par mutation des structures secondaires et tertiaires.

La structure secondaire est fondamentale pour l'activité catalytique des introns, et pour confirmer le modèle, on fait des analyses de mutation en cis (on modifie directement la séquence de l'intron).

On prends le gène de la beta-galactosidase dans lequel on ajoute l'intron de type I (on fait cette construction dans un plasmide).

Une fois dans la cellule bactérienne, on lui donne un substrat (X-Gal) incolore, et dès que la beta-galactosidase coupe la liaison, le X devient bleu. Donc on voit que l'intron de type 1 fonctionne. Si on mute l'intron et qu'on modifie sa structure secondaire, les colonies seront blanches, et donc il n'y aura plus d'activité catalytique.[pic 3]

On peut refaire des mutations jusqu'à que l'une d'entre elles permette de récupérer l'activité catalytique normale, mais avec une séquence en nucléotide différente.

Les structures secondaires interagissent entre elles aussi pour former des structures tertiaires. Elles font intervenir les boucles de l'intron qui interagissent entre elles. A l'intérieur des boucles, on trouve des tétraboucles (tétralogs) constituées de 4 nucléotides (GNRA). C'est au travers de ces séquences que les interactions tertiaires se forment à l'intérieur de l'intron. Il y a des interactions hydrogène comme s'il s'agissait de paires de bases classiques, avec parfois des interactions boucles-tiges qui conduisent à la formation de triplets (3 bases qui s'associent). Ceci permet à l'intron de se replier sur lui-même.

Analyse de covariance : on fait varier la séquence d'une tétraboucle, et on regarde avec quelle région elle interagit normalement.

Les structures secondaires et tertiaires sont essentielles pour l'activité catalytique de l'intron.

- Les ions métalliques.

Les introns de types 1 sont qualifiés de métallo-enzymes. Ces structures ont besoin d'ions métalliques pour pouvoir fonctionner correctement ; ce sont notamment des ions divalents.

Rôle des ions divalents :

- repliements de l'intron en conformation active : structures secondaires et tertiaires et stabilisation du squelette ribose-phosphate de la molécule

- chimie de la réaction de catalyse = coordination des atomes d'oxygène des différents ligands :

- du groupement nucléophile qui initie la réaction

- de groupement qui est éliminé

- de la liaison phosphodiester clivée

Pour le maintien de la structure secondaire et tertiaire, on a 3 ions essentiels :

- Mg2+

- Mn2+

- Ca2+

Ils interviennent dans la chimie de la réaction catalytique.

Seuls le Mg et le Mn sont capables de maintenir l'activité catalytique de l'intron. Le plus efficace est le Mg.

Le Ca maintient la structure tertiaire de l'intron, mais pas son activité.

- La réaction d'autoépissage.

Elle a été découverte initialement chez Tétrahymena thermophila (protozoaire cilié). C'est un modèle en biologie. Il possède un ARNr qui provient d'un ADN qu'on qualifie d'ADNr (= épisome =ADN circulaire indépendant avec réplication autonome ; ils peuvent parfois être intégrés dans le génome cellulaire). Cet ADNr est complètement autonome. Ces ARNr sont synthétisés sous forme de précurseur (pré-ARNr).

Dans la partie 26S, on trouve une région IVS = intervening sequence (= intron) qui doit sortir du préARNr pour donner un ARNr mature.

[pic 4]

[pic 5]

Cette réaction d'épissage fait intervenir aussi une guanosine, externe à l'intron, comme cofacteur.

Sa présence est indispensable et aucune autre base ne peut substituer la guanosine. Néanmoins, toutes les formes de guanosine fonctionnent (GMP, GDP, GTP) pour la réaction d'épissage de l'intron de type 1.

La réaction ne nécessite donc pas d'énergie (on n'a pas hydrolyse des groupements phosphates). La guanosine doit avoir un groupement -OH libre pour que la réaction ait lieu : groupements hydroxyles qui vont être utilisés pour la réaction de catalyse (ne fonctionne pas avec la désoxyG). La réaction d'auto-épissage peut être suivie par l'utilisation d'une forme marquée (radioactive) de la guanosine.

La catalyse s'effectue selon 3 réactions de transfert successifs au cours de la réaction d'épissage (réactions de trans-estérification) :[pic 6]

- 1ère réaction :

- la guanosine agit comme un cofacteur qui attaque l'extrémité 5' de l'intron : attaque nucléophile

- cela