Séparation de l'alanine et l'arginine

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notre dosage spectrophotométrique, on aura comme chromophore le pourpre de Ruhuemann. De plus, on sait que sa quantité de matière est proportionnelle à la quantité de matière de l’acide aminé présent dans la solution, on pourra donc le déterminer.

Une fois le chromophore introduit dans notre solution contenant l’acide aminé, nous allons faire passer une faisceau lumineux monochromatique de longueur d’onde lambda dans une cuve qui possède une épaisseur l et ainsi, notre solution a une concentration c en chromophore.

Ce dosage est basé sur la loi de Beer-Lambert qui est :

D’après cette formule, on peut dire que l’absorbance est proportionnelle à la concentration du chromophore, donc à la concentration initiale en acides aminés.

En revanche, nous ne connaissons pas l’absorbance de notre solution, donc avant de mesurer nos échantillons, nous allons réaliser une gamme étalon. Cette dernière est établie grâce aux tubes contenant le réactif à doser à des concentrations connues.

Notre longueur d’onde maximum est de 570 nm. Nous allons donc travailler à cette longueur d’onde pour ainsi mesurer l’absorbance de chaque solution et ainsi que celle d’un essai à blanc ne contenant pas d’acide aminé mais seulement du chromophore.

Ainsi, la mesure de notre essai à blanc permet de soustraire cette absorbance aux autres trouvées et de calculer par la suite l’absorbance réelle.

Enfin, grâce aux absorbances réelles, on pourra donc tracer la droite A = f(quantité d’acide aminé).

Puis dans un second temps, nous allons réaliser l’absorbance de la solution à titrer. Pour obtenir l’absorbance réellement due à la présence du chromophore, il faut réaliser un essai à blanc également. Puis la valeur de cet essai à blanc sera soustraite aux autres valeurs ce qui nous permettra d’obtenir la valeur de l’absorbance réelle.

A partir de ces absorbances, nous pourrons donc déterminer par lecture graphique sur la droite d’étalonnage la quantité d’acide aminé qui est contenue dans notre solution et donc sa concentration.

La réaction à la ninhydrine n’étant pas spécifique à un seul acide aminé, nous vérifierons que nous n’avons pas travaillé sur le mélange des deux acides aminés lors du dosage spectrophotométrique et ainsi vérifier que la séparation est bien effective.

Pour vérifier si la séparation est bien effective, nous allons utiliser une réaction spécifique à l’acide aminé non étudié lors du dosage (réaction spécifique dans notre TP à l’arginine).

La réaction se fait en présence d’alpha-naphtol et d’hypobromite de sodium qui en milieu alcalin donne une coloration rouge-orangé.

Dosage d’arginine par l’alpha-naphtol et hypobromite de sodium

La réaction d’arginine avec l’alpha-naphtol et l’hypobromite de sodium est une réaction chimique spécifique de cet acide aminé. Cette réaction est connues comme le test de Sakaguchi et le complexe d’alpha-naphtol et hypobromite comme le réactif de Sakaguchi.

Ainsi, lors de cette réaction, on observe une interaction entre le groupement guinidine qui est spécifique de l’arginine. Ce qui permet de donner un composé chromophore.

Le mécanisme de cette réaction est le suivant :

La réaction se développe en milieu très basique, pour que le groupement guanidine soit déprotoné et ainsi soit capable d’entrer en réaction avec l’alpha-naphtol.

Pour conclure, nous connaissons la concentration totale en acides aminés de la solution et nous pourrons donc en déduire la concentration du second acide aminé en utilisant la formule suivante :

Carginine = Ctotale - Calanine

3 - Résultats

Nous réalisons donc une chromatographie par échange d’ions. Précédemment, nous avons dis qu’on devait réaliser cette chromatographie en deux étapes. Pour cela, nous allons déterminer l’ordre d’élution des acides aminés.

Pour réaliser ce TP, nous avons à notre disposition un mélange de deux acides aminés qui sont :

- l’arginine

- l’alanine

Nous allons préciser les caractéristiques de ces deux acides aminés. 
En ce qui concerne l’alanine, ce dernier a pour formule :

Cet acide aminé ne possède pas de groupement acide ou basique dans sa chaine latérale. Nous pouvons donc dire qu’il existe sous trois formes différentes qui varient en fonction du pH. Ainsi, on obtient :

Nous connaissons les deux pKa, ainsi nous pouvons donc calculer le pHi de cet acide aminé par la formule suivante et nous obtenons le résultat suivant :

Nous allons donc faire de même pour notre deuxième acide aminé qui est l’arginine qui a pour formule :

Cette acide aminé possède un groupement supplémentaire dans sa chaine latérale et donc nous pouvons dire qu’il existe sous quatre formes différentes qui varient en fonction du pH. Ainsi, on obtient :

Nous connaissons les deux pKa, ainsi nous pouvons donc calculer le pHi de cet acide aminé par la formule suivante et nous obtenons le résultat suivant :

Nous allons donc utiliser deux éluants :

- le premier est un tampon acétate à 0,1 mol/L de pH=4,2

- le deuxième est une solution d’hydroxyde de sodium à 1 mol/L

On peut conclure que le premier tampon est un tampon acide en revanche pour le deuxième éluants, on ne connait pas le pH de la solution.

L’hydroxyde de sodium de formule NaOH, peut aussi s’écrire (NA+,OH-).