Technique d'étude de la cellule

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à la taille de la cellule, celui du fond à la complexité de la cellule. On obtient une formule sanguine. (diagramme taille/granulosité -> crée des amas de cellules sur le graphique)

Permet d’obtenir le pourcentage de composants du sang car les cellules sont comptées. La technique est utilisée pour la sélection de cellules ayant ou non des protéines à leur surface marquées par des anticorps fluorescents.

On peut également tracer des diagrammes selon 2 paramètres (deux fluorescences) en abscisse : vert (LITC), en ordonnée ; rouge (PE) en abscisse. On a alors en bas à gauche la population négative. En haut à droite, la population doublement positive.

Permet l’étude du cycle cellulaire en introduisant un composant qui se fixe sur l’ADN.

Trieur de cellules par cytofluorimétrie en flux (fluorescence activated cell sorter : FACS)

Analyse ultra rapide d’une suspension cellulaire ; Les cellules en suspension diluée passent une par une dans une chambre d’analyse éclairée de plusieurs lasers. Elles sont déviées selon leur fluorescence. (selon leur charge magnétique) On récupère les cellules en plaçant des tubes en dessous des plaques chargées positivement ou négativement.

La recherche (fonction immune, cancer, biologie moléculaire), la clinique (diagnostic in vitro, transplantation, transfusion, thérapie cellulaire), la pharmacologie (identification et validation de composés) et l’industrie (environnement, agriculture) utilisent cette technique.

Microdissection laser

Tissu paraffiné. On utilise le laser et un emporte-pièce pour découper les cellules intéressantes de l’échantillon. (parfois une seule cellule)

Première utilisation de la microdissection à laser par Patricia Deschaux pour repérer les cellules fœtales circulant dans le sang maternel (détection des trisomies).

Exploration moléculaire

Fractionnement subcellulaire

Sert à ne récupérer que la partie intéressante de la cellule. On le fait par centrifugation différentielle : de plus en plus vite, de plus en plus longtemps. On récupère les noyaux en premier. Puis les mitochondries, le réticulum, les ribosomes. On récupère le surnageant et on re-centrifuge après.

Ou par gradient de densité :

On place une solution très lourde au fond. Puis on ajoute des gouttes d’une solution légère. Se met en haut. Puis encore plus faible, se met au dessus. Cela crée des zones de densité. On dépose ensuite la fraction à analyser. Puis on centrifuge. Cela permet des différences de densité très fines. On peut récupérer la zone intéressante par des seringues sans récupérer les autres (tube en plastique).

Techniques d’analyse de l’ADN, de l’ARN, et des protéines

Southern Blot pour l’ADN. On applique une électrophorèse de l’anode négative à la cathode positive, à l’aide d’enzymes de restriction. On place le gel dans la soude (pour rendre l’ADN monocaténaire) On place une membrane sur le gel, puis du papier par-dessus, le tampon humidifie le gel, et l’ADN s’imprime sur la membrane. On place la membrane sous UV pour fixer les gènes. On utilise des sondes d’ADN monocaténaires (vingt paires de bases) qui s’hybrident avec les ADN de la membrane. -> détection des gènes recherchées. On place l’ensemble contre un film de radio pour voir le résultat.

Pour l’ARN, même système : Northern Blot.

Pour les protéines, idem, Western Blot. Le déplacement durant l’électrophorèse se fait selon la taille de la protéine. On utilise des anticorps et non des sondes.

DNA array : (gros Northern Blot) L’ARN lévite dans le milieu ambiant, sondes sur la lame de couleur différente selon l’expression du gène.

Des logiciels interprètent la luminosité de chaque point de la plaque contenant un ADN différent et en déduisent une mesure numérique de l’expression de chaque gène. Si le lot d’ADNc n°1 (plantes non traitées) est marquée en vert et que le lot d’ADNc n°2 (plantes traitées) est marquée en rouge alors :

Les gènes dont l’expression est augmentée suite au traitement apparaissent alors en rouge.

Les gènes peu affectés par le traitement apparaissent en vert.

Les gènes dont l’expression est forte dans les deux conditions apparaissent en jaune.

Les gènes peu exprimés n’apparaissent pas.

Et aussi...

Il existe deux grandes familles de puces à ADN, l’une ne pouvant recevoir qu’un échantillon de cellule par plaque (mais pouvant contenir beaucoup plus de gènes fixés sur la plaque) et l’autre pouvant recevoir deux échantillons différents, chacun labélisé avec un fluorochrome de couleur différente : sur l’image, un point vert sera donc un gène exprimé dans la cellule saine tandis qu’un point rouge sera un gène exprimé dans la cellule malade. Un point jaune est exprimé dans les deux cellules et un point noir dans aucune...

Il existe aussi de très récentes puces à protéines qui permettent d’étudier le protéome d’une cellule donnée. Ce sont cette fois des antigènes qui sont fixés sur la plaque.

Pénétration intracellulaire de molécules

Microinjection : Une pipette aspire la cellule, on fait un trou dans la membrane puis on injecte directement dans la cellule. Technique longue.

Electroporation : On crée un champ électrique qui crée des trous dans la membrane, pour faire pénétrer les éléments intéressants. Abîme la cellule.

Liposomes : la membrane est composée d’un feuillet lipidique. Le liposome s’intègre à cette membrane, et les éléments à l’intérieur du liposome sont libérés à l’intérieur de la cellule.

ELISA : enzyme linked immunosorbent assay

L’anticorps éventuel est fixé par un antigène portant une protéine liée à un anticorps spécifique de la protéine, lui-même lié à une enzyme et à son substrat de l’enzyme, qui donne une coloration ou une luminescence.

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