TP électrophorèse de protéines, électrotransfert et immunorévélation

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Interprétation du gel de polyacrylamide 15%

Les pistes 1 et 3 sont des échantillons contenant les marqueurs moléculaires sans ßmercaptoéthanol pour la piste 1 et avec ß-mercaptoéthanol pour la piste 3.

On peut voir 6 bandes sur les deux pistes correspondant aux molécules du marqueur allant de la plus grosse masse moléculaire à la plus petite. Or, on sait que la Phosphorylase B (376 000 Da) est constituée de 4 sous-unités protéiques identiques (tétramère).Les sous unités étant reliées entre elles par des ponts disulfures interchaînes, on devrait donc observer une tâche de 94 000 Da (376/4) donc sur la piste 3 on aurait dû obtenir un résultat différent. => Information sure et certaine regarde ton TD

Les pistes 2 et 4, on a mis l’alcool déshydrogénase en absence de ß-mercaptoéthanol pour la piste 2 et en présence de ß-mercaptoéthanol pour la piste 4.

On observe une bande sur la piste 2 alors que dans la piste 4, on observe deux bandes. On sait que le ß-mercaptoéthanol coupe les ponts disulfures, on peut donc déduire que l’alcool déshydrogénase est composé de 2 sous-unités liées par un pont disulfure.

Distance de migration de la bande de la piste 2 = 1,6 cm

Après lecture graphique, Log (MM) = 4,6 MM = 39 800 Da

Distance de migration de la bande A de la piste 4 = 1,7 cm

Après lecture graphique, Log (MM) = 4,55 MM = 35 480 Da

Distance de migration de la bande B de la piste 4 = 2,4 cm Après lecture graphique, Log (MM) = 4,5 MM = 31 620 Da

Ceci voudrais donc dire que le poids réelle de l’ADH serait environ 67100 Da or la bande sur la piste 2 ne fait que 39800 Da donc notre résultat n’est pas logique. Cependant, une autre hypothèse serait qu’elle possède des sous-unités reliées par un autre type de liaison, assez faible, pour avoir été dénaturé par le SDS. Dans ce cas, il est possible que la tâche observée sur la piste 2 regroupe plusieurs sous-unités : l’ADH serait alors constituée de plusieurs sous-unités protéiques identiques valant chacune environ 39000 Da chacune

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La piste 5 correspond à la fraction comprenant la totalité des protéines contenues dans le blanc d’oeuf. On sait que cette fraction contient 4 protéines (comme présentée dans le fascicule du TP Lysozyme), or on ne peut voir que 2 bandes. On sait que l’absence de bande correspondante à la Conalbumine est due au pouvoir résolutif du gel, car celle-ci possède une masse moléculaire (87 000 Da) qui est en dehors des limites de d’exclusion du gel. On ne voit pas non plus la bande qui devrait correspondre au lysozyme. Cela peut être dû à une à une erreur de manipulation les autres ont la tache or ttes nos F1 sont identiques donc nous auusi on devrait l’avoir c’est pourquoi je parlerai plutôt d’érreur de manip La piste 6 correspond à la fraction comprenant les protéines contenues dans le blanc d’oeuf excepté le lysozyme. On devrait donc obtenir les mêmes bandes que sur la piste 5 sauf la bande correspondante au lyzozyme car L’échantillon F2 ayant été obtenu après contact avec la résine échangeuse d’ions, le lysozyme a été en principe retenu par la résine, et donc les autres protéines sont récupérées dans cette fraction F2 (je ne comprends pas pk tu parles de 3 bandes alors que nous on a observées que 2).

La piste 7 correspond à la fraction d’élution obtenue lors du TP précédant, comprenant le lysozyme pur. On observe une bande d’une distance de migration de 5 cm. Après lecture graphique, on obtient une masse moléculaire égale à 15 900 Da. On sait que la masse molaire du lysozyme est d’environ 14 000 Da, donc on peut dire qu’il s’agit du lysozyme.

Interprétation de la coloration au Rouge Ponceau

On observe une bande dans la faction F1. Cette fraction correspond à toutes les protéines contenues dans le blanc d’oeuf. Nous avons obtenu par électrophorèse, deux bandes dans cette fraction. Nous savons que nous aurions dû obtenir quatre bandes mais comme nous avons expliqué précédemment, deux protéines (dont le lysozyme) sont absentes, mais nous aurions donc dû obtenir le même résultat ici. Or nous savons que le rouge Ponceau n’est pas très sensible et a donc détecté la protéine en concentration plus importante. [pic 2]

On observe également une bande au même niveau que F1 dans la fraction F2. Cette fraction correspond aux protéines contenues dans le blanc d’oeuf excepté le lysozyme. Par électrophorèse, on a pu observer deux bandes pour cette fraction ; mais Le rouge Ponceau étant peu sensible, seule la protéine la plus concentrée a été colorée.

Pour la fraction d’élution E1 dans laquelle est contenue le lyzosyme, on observe une bande Intense. Celle-ci correspondrait bien au lysosyme puisque la distance de migration est la même que pour l’électrophorèse, c’est-à-dire 5 cm.

Interprétation de l’immunorévélation (annexe……) n’oubli pas de mettre nos gels en annexe et la membrane de cellulose il faut aussi légender il a dit genre mettre anode cathode pour la membrane) , sens de migration etc

On observe aucune bande pour les fraction F1 et F2 car dans la fraction F1 nous n’avions pas de bande correspondant au lysozyme dans les résultats de l’électrophorèse et de ceux obtenus après la coloration au Rouge Ponceau comme expliqué précédemment. Dans la fraction F2, nous n’avons pas de bande car cette fraction comprend toutes les protéines contenues dans le blanc d’oeuf excepté le lysozyme. Nous pouvons donc dire que le lysozyme a bien été retenu par le gel lors de la chromatographie échangeuse d’ions faite dans le TP précédant.

On observe une bande pour la fraction d’élution E1 not re truc(tu es sure ??) normalement notre truc n’a pas fonctioné et la grosse tache c’est au niveau de F1 n’a pas fonctionné. On peut donc confirmer l’hypothèse émise lors de l’interprétation au rouge Ponceau, qui est que la bande correspond bien au lysozyme puisque cette l’immunorévélation est spécifique à la protéine d’intérêt. Ce résultat montre que le lysozyme a bien été élué dans cette fraction.

Donc voici ce que je propose

Notons que l’immunorévélation semble ne pas avoir fonctionné ici : la membrane traitée comporte comporte qu’une seule tache au niveau de la piste

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