Les morts cellulaires (biologie cellulaire)

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B - La voie extrinsèque

Découverte d’une nouvelle voie dépendante de récepteurs membranaires : des Ac en contact avec des cellules peuvent induire un phénomène d’apoptose en s’hybridant sur des récepteurs membranaires : les récepteurs de mort.

Les récepteurs de mort sont composés de trois domaines extra cellulaires variables riches en Cystéine et d’un domaine intra cellulaire ou domaine de mort (commun à tous les récepteurs). Le récepteur se trimérise à la suite de l’hybridation d’un ligand. Cette trimérisation fait intervenir une cascade de signalisation via FADD (adaptateur) qui permet l’auto activation de la pro caspase 8 qui va cliver la caspase 3 inactive et donc induire le phénomène d’apoptose.

[pic 6]Le TNF et le ligand FAST sont des signaux extra cellulaires intervenant dans la voie extrinsèque. Il existe des liens entre la voie intrinsèque et extrinsèque, la caspase 8 induisant une dégradation de Bid, la voie extrinsèque activera la voie intrinsèque.

V - Méthodes d’études de l’apoptose

A - Méthodes communes aux deux voies

[pic 7]La présence de phosphotidylsérine (PS) dans le feuillet externe de la membrane plasmique est un des marqueurs de l’apoptose qui déclenche un signal « eat me » perçu par des récepteurs à la surface des macrophages. Le marquage de cellules non perméabilisées avec de l’annexine V, FITC et d’un marqueur à l’ADN permet la reconnaissance spécifique des cellules en apoptose précoce. Cette technique permet également la reconnaissance non spécifique des cellules en apoptose très tardive ou nécrotique (perméabilisation cellulaire donc coloration de l’ADN et PS interne).

Coupure de l’ADN :

Lors de l’apoptose, l’ADN génomique est fragmenté selon un facteur de 180pdb, une analyse par électrophorèse sur gel d’agarose avec un marqueur à l’ADN permet l’obtention d’une graduation de facteur 180pb chez les cellules apoptotiques. L’analyse FACS du contenu en ADN de cellules perméabilisées et marquées à l’IP montre un pic sub G1 chez les cellules apoptotiques.

Essai TUNEL (coupure de l’ADN) :

Cette technique permet la détection de fragment d’ADN grâce à une transférase TdT en ajoutant un fluorophore sur leur extrémité 3’ OH (Ac couplé à une enzyme ou fluorophore/B).

Activation des caspases 3 :

On peut analyser l’activation par clivage de la caspase 3 en Western Blot, les cellules apoptotiques révèlent une bande pour la caspase clivée et une bande pour la caspase inactive. On peut également étudier l’activation de la caspase 3 en réalisant une analyse de clivage par fluorescence (Rhodamine 100).

B - Méthodes permettant une différenciation des voies

Etude de l’activation des caspases 8/9 :

Analyse de l’expression des différentes caspases par Western Blot, la caspase 8 étant spécifique de la voie extrinsèque.

Etude de la localisation du cytochrome C : Analyse des fractions cytosoliques et mitochondriales par Western Blot, les cellules apoptotiques se caractérisent par la présence du cytochrome C dans le cytosol. Analyse par microscopie à fluorescence avec des marqueurs Bax et CytoC.

C - Analyses cytologique et moléculaire

L’observation de cellules en microscopie électronique à transmission, en microscopie optique avec des colorants vitaux et en microscopie à fluorescence avec une coloration de l’ADN permet la différenciation des cellules en mort cellulaire.

[pic 8]

[pic 9]

L’utilisation en FACS d’une sonde fluorescence qui se lie covalemment aux caspases activées et d’un colorant vital permet la détection de cellules en nécrose et en apoptose précoce et tardive différenciation).

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