FRACTIONNEMENT CELLULAIRE, ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES MITOCHONDRIES.
Par Plum05 • 5 Septembre 2018 • 1 053 Mots (5 Pages) • 621 Vues
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l’aide de cyanure pour résulter à une accumulation de cytochrome c réduit. On rappelle que lorsque le complexe IV n’est pas en présence de cyanure, les réactifs sont l’oxygène et le succinate et donnent du furamate et de l’eau. On aura donc besoin de trois cuves pour mener à bien cette expérience. La cuve 1 va nous permettre de faire le blanc c’est-à-dire qu’on va mettre tout ce qui absorbe à 550 nm (fraction mitochondriale et cytochrome c) plus du tampon phosphate. La cuve 2 contient du cyanure et la cuve 3 sert de cuve témoin pour voir ce qu’il se passe en condition « normale ». (cf courbes en annexe).
Résultats et discussion
La courbe de l’échantillon 1 (rouge) montre une augmentation. Cependant, de 0 à 3 min la courbe montre une très forte augmentation pour ensuite se stabiliser jusqu’à 20 min.
Cette courbe correspond à l’absorbance de la cuve 2. La présence de cyanure qui inhibe le complexe IV est bien démontré ici puisque l’augmentation constante de l’absorbance montre bien une accumulation du cytochrome c réduit.
La forme de la courbe, fortement croissante puis stable peut être expliquée par une rapide accumulation de cytochrome c réductase dans le complexe IV mais une saturation est possible c’est-à-dire qu’il n’y a plus de place pour la formation d’autres cytochrome c réductase et donc conduit à une immobilisation totale du complexe, d’où la stabilisation de la courbe autour de 3 min.
L’origine de la courbe aurait dû être à l’origine du repère. Cette imprécision peut venir du blanc ou de nos manipulations.
La courbe de l’échantillon 2 (vert) qui est en négatif montre une diminution de 0 à 2 min puis une stabilisation voire une légère augmentation jusqu’à 20 min. Courbe correspond à la cuve 3 sans inhibition au cyanure.
La négativité de la courbe peut s’expliquer par le fait que le blanc absorbe plus à 550nm que cet échantillon ou bien peut être dû à une mauvaise manipulation, mauvais pipetage ou mauvaise homogénéisation. La décroissance de la courbe peut être expliqué par décantation c’est-à-dire que les molécules de cytochrome c aurait tendance à aller vers le fond de la cuve et ne seraient plus traversés pas le faisceau lumineux du spectrophotomètre.
Dans les faits, on s’attendait à avoir une courbe croissante puis décroissante par intermittence mais la solution n’est pas parfaitement homogène et les réactions d’oxydation et réduction ne peuvent pas exactement se compenser. La légère croissance de la courbe peut indiquer qu’un sens de réaction est plus favorable (ici la réduction). Soit l’homogénéisation n’est pas bonne ou bien il y a plus importante de molécules de succinate que l’oxygène.
Après 20 min, on peut émettre l’hypothèse que soit la courbe devient stable et les réactions d’oxydation et de réduction trouvent un équilibre, soit elle va légèrement décroitre puis croitre et donner cet effet d’intermittence qu’on pouvait attendre.
Conclusion
L’isolement des mitochondries par fractionnement cellulaire et l’étude in vitro de l’activité « succinate cytochrome c réductase » de la chaîne respiratoire à démontré la présence des réactions d’oxydo-réduction du métabolisme respiratoire grâce à l’inhibition du complexe IV sur des fractions mitochondriales. Cependant, nos résultats ont été assez perturbés par manque d’homogénéisation.
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