Trypsine

...

- Calcul des volumes finaux

Le volume final du milieu réactionnel en présence d’enzyme :

vfinal= (vsubstrat + venzyme)

Par exemple, pour venzyme = 30μL on a vfinal = 2×10­3 + 30×10­6= 2,03×10­3 L

- Conversion des vitesses ∆A/min en nmol pNA/min

Pour les volumes d’enzymes de 20 μL ,30 μL, 40 μL, 50 μL, le ε vaut toujours 8857,14 L.M­1.cm­1 , d’où la vitesse en nmol p­NA/min = (vitesse∆A/min-1⁡×Vfinal)/ε

Donc, par exemple, si on calcul la vitesse pour un volume d’enzyme v=30 μL, on a :

v = ((2,03 ⁡× (2,03×10­3)) / (8857,14)) ×10­9 = 554,19 nmol p­NA/min

Essai

1

2

3

4

Z-Arg-p-NA 2mM (mL)

2

2

2

2

Enzyme (μL)

0

20

30

40

50

Vitesse (∆A/min)

0

1,4556

2,4180

2,8392

4,0392

Vitesse (nmol pNA/min)

0

331,97

554,19

650,72

925,75

Vfinal (mL)

0

2,02

2,03

2,04

2,05

TABLEAU 2 : résultats des vitesses initiales en ∆A/min, converties en nmol pNA/min.

3) Etude de l’influence de la concentration en substrat (programme Trypsine C)

- Calcul du volume total vtotal

Le volume final du milieu réactionnel en présence d’enzyme :

vfinal= (vsubstrat + venzyme + vtampon)

Avec : venzyme= 40μL et vsubstrat +vtampon= 2mL

Ainsi vtotal = (2×10­3+ 40×10­6)= 2,04×10­3 L

- Calcul de la concentration réelle de substrat dans le milieu réactionnel en présence de l’enzyme

Csubstrat dilué × Vprélevé= Créelle × Vtotal

Ainsi Créelle= (Csubstrat dilué ×Vprélevé)/Vtotal

Avec [Z-Arg-p-NA] = 2mM et vtotal = 2,04×10­3 L

Par exemple, avec un volume de substrat prélevé de S = 0,10mL, on a :

[S] = ((2×10­3) × 0,10) / (2,04 ×10­3) = 0,0981 mM

- Conversion des vitesses ∆A/min en nmol pNA/min

De plus, on a ε= 8857,14 L.M­1.cm­1.

D’où la vitesse en nmol p­NA/min : (vitesse∆A/min-1⁡ × Vfinal) / ε

Donc, par exemple, si on calcul la vitesse pour un volume de substrat de 0,5 mL, on a :

v = ((2,501 ⁡× (2,04×10­3)) / (8857,14)) ×10­9 = 576,1 nmol p­NA/min

S (mL)

0,00

0,10

0,15

0,20

0,50

1,00

1,50

2,00

[S] (mM)

0

0,0981

0,147

0,196

0,490

0,980

1,471

1,961

Vitesse (∆A/min)

0

1,612

0,616

0,665

2,501

2,603

2,333

2,540

Vitesse (nmol pNA/min)

0

371,3

141,9

153,2

576,1

599,5

537,3

585,0

TABLEAU 3 : résultats des vitesses initiales en ∆A/min, converties en nmol pNA/min.

4) Interprétation de la courbe vitesse = f(temps) présente en annexe 1 d’après les résultats consignés dans le tableau n°1

- Schéma réactionnel :

[pic 2]

Avec :

- k1 = constante d'association de E + S

- k-1= constante