Théorie de la topologie de l’ADN

...

k

sont appelés des topoisomères. Il existe une

classe d'enzymes capables de modifier L

k

: les ADN topoisomèrases. Ces enzymes coupent

transitoirement 1 ou 2 brins de la double hélice afin de permettre les échanges de brins et modifient

ainsi le nombre d'enlacements. Une topoisomèrase de type I coupe 1 brin et l'autre brin passe à travers

la brèche, et à chaque passage de brin, L

k

varie par saut de 1. Une topoisomèrase de type II coupe 2

brins à la fois, permet une rotation des 2 brins et à chaque cycle L

k

varie par saut de 2. Une

topoisomèrase II permet également de séparer des double hélices enlacées, c'est la réaction de

décaténation (voir diaporama).

La forme B de la double hélice d’ADN :

La forme B de la double hélice de l’ADN possède les caractéristiques suivantes : les plateaux successifs de paires de bases sont distants de 0,34 nm et forment un angle de 36° (twist ou

).

Soit une molécule d’ADN double brin circulaire de 1000 pb en structure B

1) Déterminer la longueur de la molécule et le nombre de tours d’hélice.

2) Quand une molécule de bromure d’éthidium (BEt) s’intercale entre 2 plateaux, elle augmente la distance entre 2 paires de bases de 0,34 nm et diminue l’angle de 26° (le faisant passer à 10° au lieu de 36°). Déterminer la longueur de la molécule d’ADN et le nombre de tours d’hélice pour un BEt intercalé toutes les 10 paires de bases.

=

L

k

= L

k

L

k

/ L

k0

L

k

- L

k0

=

Dans la cellule

3

,

ou densité de supertours :

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3) En admettant que le nombre de lien L de la molécule d’ADN native est équivalente au nombre de tours d’hélice T déterminé en 1), déterminer qualitativement et quantitativement les effets du BEt sur la topologie de cet ADN ? Justifier votre réponse.

Utilisation de l'énergie de surenroulement de l'ADN

L'ADN surenroulé négativement (qui est la forme d'ADN rencontrée pour les plasmides, certains bactériophages, et la quasi-totalité des chromosomes bactériens) possède une énergie potentielle qui peut être libérée pour modifier de diverses façons la géométrie de la double hélice. Les 3 exemples ci-dessous illustrent 3 utilisations possibles de cette énergie.

On considère un plasmide de 4320 pb dans les conditions standard (25°C, pH 7,0 et 0,1M NaCl). Ce plasmide est surenroulé négativement, avec un vrillage Wr = -25 et un Lk = 384. Il contient en outre une séquence répétée (AT)34 (voir d).

a]Déterminer la valeur de h0, nombre de paires de bases par tour dans ces conditions physico-chimiques.

b] On relâche, dans les mêmes conditions standard cet ADN plasmidique par une topoisomérase I, qui coupe transitoirement l'un des brins de l'ADN pour éliminer les contraintes, puis referme. Dans ce cas, l'énergie de la superhélice est dissipée pour amener l'ADN dans un état de moindre énergie. Donner les valeurs de Tw, Lk, et Wr après relaxation complète.

c] Toujours dans les conditions standard, au plasmide initial (surenroulé négativement) à la concentration de 30 μM (concentration en pb), on ajoute du bromure d'ethidium (BET) à la concentration totale de 2,4 μM.

En supposant que la constante d'affinité tend vers l'∞ et que chaque molécule de BET détord de 26° d'angle la double hélice d'ADN, donnez les valeurs de Lk, Tw, Wr pour cet ADN en présence du BET. Sous quelle structure se trouve cet ADN? Quelle est la valeur de h0? À quoi a pu servir l'énergie de surenroulement?

d] Toujours dans les conditions standard, on sépare les brins du plasmide initial au niveau de sa séquence (AT)34 à l'aide d'une protéine qui stabilise l'ADN simple brin (SSB). Si l'on suppose que la totalité de la séquence de 34 AT n'est plus en double hélice, déterminer les valeurs de Lk, Tw, Wr.

Dire à quoi a servi l'énergie de surenroulement dans ce cas, sachant que si l'on tente la même expérience à partir de l'ADN obtenu aprés action de la topoisomérase I (question b), les deux brins ne se séparent pas.

NB : les parties a, b, c, d sont indépendantes

Topologie de l’ADN et migration électrophorétique

But de l’exercice : Comprendre la relation entre les diverses formes topologiques d’un ADN circulaire et leur comportement lors d’une électrophorèse

4

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Les bactéries produisent des plasmides qui naturellement adoptent une structure de type FI. Considérons l’ADN du plasmide pET21. La forme FI de ce plasmide (5439 pb) dans les conditions standard (25°C, pH 7 et 0,1 mol.L-1 NaCl) présente un superenroulement négatif (W=-26).

1) Définir les

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