La lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d’affinité
Par Raze • 24 Novembre 2018 • 1 284 Mots (6 Pages) • 652 Vues
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Protéine totale dans la fraction :
Concentration moyenne non diluée x volume total de la fraction
Calcul de la pente :
Calcul de la vitesse initiale dans la cuve :
Vi =
Δc = M/min x 1000 μmol/min
Activité total :
At =
Pour le calcul de l’activité spécifique, il est nécessaire de connaitre la concentration en protéine de notre extrait. Pour cela nous réalisons un dosage des protéines par la méthode de Bradford.
Protéines totales dans la fraction :
Concentration moyenne non diluée x volume total de la fraction
Enrichissement :
Rendement :
x100
Activité spécifique :
L’enrichissement est supérieur à 1 et le rendement est de 120 % donc la protéine a bien été purifiée.
III/ Dosage des protéines par la méthode de Bradford
La méthode de Bradford est un dosage colorimétrique qui se fait à 595nm et permet le dosage des protéines. Le réactif de Bradford (le bleu de Coomassie) se fixe sur les résidus hydrophobes des acides aminés basiques des protéines. Ainsi on peut doser la concentration en protéine d’une solution en fonction de la fixation du réactif de Bradford qui créé une coloration bleu plus ou moins vive. La gamme étalon est faite de sérum d’albumine de bœuf (BSA). Ce dosage permet également de juger de la pureté donc de l’efficacité de la chromatographie d’affinité réalisée en mesurant en quelle quantité la protéine voulue est présente.
- Tracé de l’absorbance en fonction de la concentration (gamme étalon), puis par lecture graphique on retrouve les valeurs des inconnues (feuille annexe 2) pour la quantité de protéine
Volume de BSA =
Volume d’H2O = Vtotal (1000) – (Vréactif de Bradford + Vbsa)
Dosage des protéines
Gamme étalon
Essais
Fraction extrait 1/10
Fraction purifiée
μL BSA 0,1 mg/mL
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
μL fraction à doser
5
15
20
H2O (μL)
500
480
460
440
420
400
495
485
480
Absorbance lue (595 nm)
0,346
0,413
0,502
0,541
0,598
0,590
0,483
0,552
0,475
Absorbance corrigée
0
0,067
0,156
0,195
0,252
0,244
0,137
0,206
0,129
μg de protéines
0
2
4
6
8
10
4,47
6,6
4,2
Concentration protéique de la fraction (mg/mL)
0,298
0,44
0,21
Concentration moyenne (mg/mL)
0,369
0,164
Concentration moyenne non diluée (mg/mL)
3,69
1,64
Absorbance corrigée = Absorbance lue – Abs0
Concentration protéique = Masse protéique/fraction à doser
Concentration moyenne non diluée = Concentration moyenne x 10 (facteur de dilution)
Ces mesures permettent de retrouver la quantité de protéines totale et donc de compléter les dernières valeurs du tableau précédent.
IV/ Electrophorèse en milieu dénaturant (SDS-PAGE)
L’électrophorèse est une technique qui permet la séparation des éléments composant la ou les solutions déposées sur la ligne de dépôt. Le but est de séparer ces molécules en fonction de leur masse moléculaire, le SDS ayant dénaturé les protéines et les ayant toutes chargées négativement, la séparation ne se fait donc pas par leur charge électrique.
On
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